Giardia duodenum is een parasitair organisme dat giardiasis veroorzaakt, een darminfectie die vooral voorkomt bij jonge kinderen met klinische tekenen van diarree.We hebben eerder gerapporteerd dat extracellulaire G. duodenalis de activering van intracellulaire oligomerisatie-achtige receptor 3 (NLRP3) bindende nucleotiden teweegbrengt en de ontstekingsreacties van de gastheer reguleert via de secretie van extracellulaire blaasjes (EV).De exacte moleculaire patronen van de pathogeen-geassocieerde duodenokokken EV (GEV) die bij dit proces betrokken zijn, en de rol van het NLRP3-inflammasoom bij giardiasis, moeten echter nog worden opgehelderd.
Recombinante eukaryote expressieplasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 en alpha-7.3 giardins in GEV werden geconstrueerd, getransfecteerd in primaire peritoneale macrofagen van muizen en gedetecteerd door het meten van het ontstekingsdoelmolecuul caspase-1.Het p20-expressieniveau werd gescreend..G. duodenalis alpha-2 en alpha-7.3 giardines werden oorspronkelijk geïdentificeerd door het meten van NLRP3-inflammasoom (NLRP3, pro-interleukine-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 en caspase-1 p20), IL-secretie.1β-niveaus, apoptotische gevlekte proteïne (ASC) oligomerisatieniveaus en immunofluorescente lokalisatie van NLRP3 en ASC.De rol van het NLRP3-inflammasoom in de pathogeniteit van G. duodenalis werd vervolgens beoordeeld met behulp van muizen waarin NLRP3-activering werd geblokkeerd (NLRP3 geblokkeerde muizen) en pathologische veranderingen in lichaamsgewicht, duodenale parasitaire belasting en duodenaal weefsel werden gevolgd.Daarnaast onderzochten we of hiardines alfa-2 en alfa-7.3 in vivo IL-1β-secretie induceren via het NLRP3-inflammasoom en bepaalden we de rol van deze moleculen in de pathogeniteit van G. duodenalis bij muizen.
Alfa-2 en alfa-7.3 giardines induceren in vitro de activering van het NLRP3-inflammasoom.Dit leidde tot de activering van p20-caspase-1, een toename van de expressieniveaus van NLRP3-, pro-IL-1β- en pro-caspase-1-eiwitten, een significante toename van de IL-1β-secretie, de vorming van ASA-vlekken in de cytoplasma en de inductie van ASA-oligomerisatie.NLRP3-ontsteking Penisverlies verergert de pathogeniteit van G. duodenalis bij muizen.Muizen behandeld met cysten door sondevoeding van NLRP3-geblokkeerde muizen vertoonden een verhoogd aantal trofozoïeten en ernstige schade aan de duodenale villi, gekenmerkt door necrotische crypten met gekrompen en vertakkingen.In vivo experimenten hebben aangetoond dat giardines alfa-2 en alfa-7.3 de secretie van IL-1β kunnen induceren via het NLRP3-inflammasoom, en immunisatie met giardines alfa-2 en alfa-7.3 verminderde de pathogeniteit van G. duodenalis bij muizen.
Alles bij elkaar suggereren de resultaten van deze studie dat giardia alpha-2 en alpha-7.3 de ontsteking van NLRP3 bij de gastheer verhogen en de infectiviteit van G. duodenalis bij muizen verminderen, wat veelbelovende doelen zijn voor het voorkomen van giardiasis.
Giardia duodenum is een extracellulaire protozoaire parasiet die in de dunne darm leeft en jaarlijks 280 miljoen gevallen van giardiasis met diarree veroorzaakt, vooral onder jonge kinderen in ontwikkelingslanden [1].Mensen raken besmet door drinkwater of voedsel dat besmet is met M. duodenum-cysten, die vervolgens in de maag terechtkomen en via de maagsappen worden uitgescheiden.Giardia duodenum trofozoïeten hechten zich aan het epitheel van de twaalfvingerige darm en veroorzaken misselijkheid, braken, diarree, buikpijn en gewichtsverlies.Personen met immunodeficiëntie en cystische fibrose zijn vatbaar voor infecties.Infectie kan ook optreden via orale en anale seks [2].Geneesmiddelen zoals metronidazol, tinidazol en nitazoxanide zijn de voorkeursbehandelingsopties voor infecties van de twaalfvingerige darm [3].Deze chemotherapiemedicijnen veroorzaken echter nadelige bijwerkingen zoals misselijkheid, carcinogenese en genotoxiciteit [4].Daarom moeten er effectievere strategieën worden ontwikkeld om infectie met G. duodenalis te voorkomen.
Inflammasomen zijn een klasse cytosolische eiwitcomplexen die deel uitmaken van de aangeboren immuunrespons en helpen bij de verdediging tegen invasie van pathogenen en het bemiddelen in ontstekingsreacties [5].Van deze inflammasomen is het nucleotide-bindende oligomerisatie (NOD) receptor 3 (NLRP3) nucleotide-bindende oligomerisatie (NLRP3) nucleotide-bindende-achtige inflammasoom uitgebreid bestudeerd omdat het kan worden gedetecteerd door verschillende met pathogenen/schade geassocieerde moleculaire patronen (PAMP/ DAMP), herkent en activeert het aangeboren immuunsysteem.en reguleert de darmhomeostase bij veel ontstekingsziekten [6,7,8].Het bestaat uit de patroonherkenningsreceptor (PRR) NLRP3, een adapter apoptotisch gevlekt eiwit (ASC) en een effector procaspase-1 of procaspase-11.Het NLRP3-inflammasoom fungeert als gastheer tegen invasie van pathogenen, zoals waargenomen in onderzoeken naar Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] en Leishmania.[11], maar er is ook gerapporteerd dat activering van het NLRP3-inflammasoom de beschermende immuunreacties beperkt en de ziekteprogressie verergert, bijvoorbeeld bij wormen [12].Op basis van onze eerdere bevindingen rapporteerden we dat extracellulaire G. duodenalis intracellulaire activering van NLRP3-ontsteking veroorzaakt en de ontstekingsreacties van de gastheer moduleert door extracellulaire blaasjes (EV's) uit te scheiden [13].De rol van het NLRP3-inflammasoom bij G. duodenalis-infectie in vivo moet echter nog worden bepaald.
Giardins werden oorspronkelijk beschreven als structurele componenten van het cytoskelet van G. duodenalis en spelen een belangrijke rol bij de motiliteit van trofozoieten en epitheelcelhechting in de dunne darm.Om zich beter aan te passen aan de omgeving en hun pathogeniteit te vergroten, ontwikkelden G. duodenalis trofozoïeten een unieke cytoskeletstructuur bestaande uit 8 flagellen, 1 middenlichaam en 1 ventrale schijf [14].De trofozoïeten van Giardia duodenum gebruiken hun cytoskelet om de bovenste dunne darm binnen te dringen, vooral de twaalfvingerige darm, en zich te hechten aan enterocyten.Ze migreren voortdurend en hechten zich aan epitheelcellen met behulp van celmetabolisme.Daarom is er een nauw verband tussen hun cytoskelet en virulentie.Giardines specifiek voor Giardia duodenum zijn componenten van de cytoskeletstructuur [15] en zijn onderverdeeld in vier klassen: α-, β-, γ- en δ-giardines.Er zijn 21 leden van de α-giardinefamilie, die allemaal een calciumafhankelijk vermogen hebben om fosfolipiden te binden [16].Ze verbinden ook het cytoskelet met het celmembraan.Bij personen met diarree veroorzaakt door G. duodenalis komen α-giardines in hoge mate tot expressie en zijn immunoreactief tijdens infectie [17].Heterologe vaccins op basis van Giardia alfa-1 beschermden tegen giardiasis bij muizen en zijn potentiële kandidaat-antigenen voor de ontwikkeling van vaccins [18].Alfa-8 giardine, gelokaliseerd in het plasmamembraan en flagella, maar niet in de ventrale schijf, verbetert de beweeglijkheid en groeisnelheid van trofozoïeten in G. duodenalis [19].Alfa-14 giardin hecht zich aan microtubuli-structuren op flagella en beïnvloedt de levensvatbaarheid van G. duodenalis [20].Alfa-11-giardine is gedurende de hele levenscyclus in overvloed aanwezig, en overexpressie van alfa-11-giardine beschadigt G. duodenalis zelf [21].Het is echter onduidelijk of alfa-2-giardine en alfa-7.3-giardine beschermend zijn tegen G. duodenalis-infectie en hun onderliggende mechanismen.
In deze studie werden recombinante eukaryotische expressieplasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine en pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine getransfecteerd in primaire peritoneale macrofagen van muizen om gastheer-NLRP3 te activeren.Vervolgens werden ontstekingsdoelen gescreend.We hebben ook de rol van het NLRP3-inflammasoom in de pathogeniteit van G. duodenalis beoordeeld, onderzocht of alfa-2- en alfa-7,3-giardines in vivo activering van het NLRP3-inflammasoom induceren, en vastgesteld dat deze twee rollen van giardines in de pathogeniteit van G. duodenalis.Ons gemeenschappelijke doel was het ontwikkelen van veelbelovende doelen voor de preventie van G. duodenalis-infectie.
Wildtype (WT) C57BL / 6 vrouwelijke muizen van 5-8 weken oud werden gekocht bij Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, China).Muizen hadden vrije toegang tot water, kregen gesteriliseerd voedsel en werden in een licht/donker-cyclus van 12/12 uur gehouden.Vóór infectie kregen muizen ad libitum antibiotica in drinkwater aangevuld met ampicilline (1 mg/ml), vancomycine (1 mg/ml) en neomycine (1,4 mg/ml) (allemaal gekocht in Shanghai, China, kunstmatige organismen) [22 ].].Muizen die langer dan 24 uur niet meer konden eten en drinken en ≥ 20% lichaamsgewicht verloren, werden op humane wijze geëuthanaseerd door cervicale dislocatie.
WB G. duodenalis trofozoïeten (American Type Culture Collection, Manassas, VS) werden aangevuld met 12,5% foetaal runderserum (FBS; Every Green, Zhejiang, China) en 0,1% rundergal (Sigma-Aldrich, St. Missouri, VS). ).VS) onder micro-aërobe omstandigheden.Confluente trofozoïeten werden op ijs verzameld en in een verhouding van 1:4 doorgeleid voor verdere reproductie.
Giardia duodenumcysten werden geïnduceerd zoals eerder beschreven [23], trofozoïeten werden geoogst in de logaritmische fase en vervolgens verdund met inkapseling-inducerend medium, pH 7,1 (gemodificeerd TYI-S-33) tot een eindconcentratie van 1 x 106 trofozoïeten/ml.galconcentratie 0,05% medium).Trofozoïeten werden onder anaerobe omstandigheden bij 37°C gekweekt tot de logaritmische groeifase.Verander het medium in cystinducerend medium (pH 7,8; ​​gemodificeerd TYI-S-33 medium met 1% galconcentratie) en kweek G. duodenalis bij 37°C gedurende 48-96 uur, waarbij de vorming van cysten onder een microscoop werd waargenomen.Nadat de meeste trofozoïeten waren geïnduceerd om cysten te vormen, werd het kweekmengsel geoogst en opnieuw gesuspendeerd in steriel gedeïoniseerd water om de resterende trofozoïeten te lyseren.Cysten werden geteld en bij 4°C bewaard voor daaropvolgende analyses via een maagsonde bij muizen.
Extracellulaire blaasjes (GEV's) van Giardia werden verrijkt zoals eerder beschreven [13].Trofozoïeten in de logaritmische groeifase werden opnieuw gesuspendeerd in gemodificeerd TYI-S-33-medium bereid met exosome-verarmde FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israël) tot een eindconcentratie van 1 x 106 parasieten / ml en gedurende 12 uur geïncubeerd.werden uit het kweeksupernatant geïsoleerd door centrifugeren bij 2000 g gedurende 10 minuten, 10.000 g gedurende 45 minuten en 100.000 g gedurende 60 minuten.Neerslagen werden opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gekwantificeerd met behulp van een BCA-eiwittestkit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) en bewaard bij -80°C of direct gebruikt voor verdere analyses.
Primaire peritoneale macrofagen van muizen werden bereid zoals eerder beschreven [24].In het kort werden muizen (6-8 weken oud) geïnjecteerd (intraperitoneaal [ip]) met 2,5 ml 2,98% Difco vloeibaar thioglycolmedium (BD, Franklin Lakes, NJ, VS) en gevoed met 3-4 smaakpapillen.Een suspensie van macrofagen werd na euthanasie uit de buikholte van muizen verzameld en 3 keer gedurende 10 minuten bij 1000 g gecentrifugeerd.Geoogste cellen werden gedetecteerd door middel van flowcytometrie met behulp van de CD11b-marker totdat de celzuiverheid >98% was, vervolgens toegevoegd aan celkweekplaten met 6 putjes (4,5 x 106 cellen/putje) en geïncubeerd met 10% FBS (Bioindustry) bij 37°C.en 5% CO2.
RNA werd geëxtraheerd uit 1 x 107 trofozoïeten in 1 ml TRIzol-reagens (Vazyme, Nanjing, China), genomisch DNA werd geëxtraheerd uit totaal G. duodenalis RNA met behulp van MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) en complementair DNA (cDNA) werd gesynthetiseerd gebruik MonScript RTIIII Super Mix (Monad) volgens de instructies van de fabrikant.
CDS-sequentie-informatie voor het doelgen van G. duodenalis werd verkregen van de NCBI GenBank.Gebruik Primer 5.0 om specifieke naadloze kloneringsprimers voor elk doelgen te ontwerpen.De voorwaartse primer (5′-3′) bestaat uit drie delen: een overlappende sequentie met een gelineariseerde vector pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) en startcodons ATG en GNN (als de eerste base niet G is).Dit wordt gedaan om de efficiëntie van de expressie te verbeteren.Daarnaast minstens 16 bp gecombineerde basen (GC-gehalte 40–60%/Tm ca. 55 °C).De reverse primer (5′-3′) bestaat uit twee delen, een overlappende sequentie met een EcoRV-gelineariseerde vector pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) en een gecombineerde base van minimaal 16 bp.(exclusief de laatste twee haltes).basen) een codon zoals AA of GA om recombinante plasmiden in staat te stellen hun gelabelde eiwitten tot expressie te brengen).De primersequenties worden vermeld in Tabel 1 en werden gesynthetiseerd door Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Doelen werden geamplificeerd met behulp van Pfu DNA-polymerase (Tiangen, Beijing, China) of Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) met behulp van bereid G. duodenalis-cDNA als matrijs.Het eukaryotische expressievectorplasmide pcDNA3.1(+) werd gelineariseerd met restrictie-enzym EcoRV en gedefosforyleerd met behulp van Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Gelineariseerde pcDNA3.1(+) fragmenten en geamplificeerde doelgenfragmenten werden gezuiverd met behulp van een DNA-gelzuiveringskit (Tiangen) en gekwantificeerd met behulp van een Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Het pcDNA3.1(+)-fragment en elk doelgenfragment werden gerecombineerd met behulp van MonClone single-assembly-kloonmix (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) en bevestigd door DNA-sequencing met behulp van Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Endotoxinevrije plasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 en pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 werden gegenereerd met behulp van de SanPrep Endotoxinevrije Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).De concentratie werd boven 500 ng/ul gehouden om te garanderen dat de EDTA in de elutiebuffer de transfectietest niet verstoorde.Primaire peritoneale macrofagen van muizen werden gedurende 12 uur gekweekt in platen met 6 putjes met compleet RPMI 1640-medium (Biological Industries), daarna werden de cellen driemaal gewassen in warme PBS om penicilline en streptomycine te verwijderen, en vervolgens in medium aangevuld met compleet medium.Endotoxinevrije plasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 en pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) werden verdund in 125 μl Opti-MEM gereduceerd serummedium (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Vervolgens werd 5 µl Lipofectamine 2000 transfectiereagens (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) verdund in 125 µl Opti-MEM-medium met een laag serumgehalte.Bereid liposoom-DNA-complexen door het verdunde endotoxinevrije plasmide te mengen met Lipofectamine 2000 en het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te laten staan.Breng de complexen afzonderlijk over naar cellen in elk putje en meng langzaam.Na 4 uur werd het celkweekmedium vervangen door 2 ml volledig RPMI 1640-medium en werd de kweek 24 uur voortgezet.Vers celkweekmedium werd aan de cellen toegevoegd en gedurende verschillende tijdstippen geïncubeerd, afhankelijk van het testontwerp.
Eiwitmonsters van supernatanten en cellysaten werden bereid zoals eerder beschreven [25].Membraanoverdrachtsparameters voor pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actine en His-tag waren 200 mA/90 min.Voor interleukine 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, VS), caspase-1 (p20) (Adipogen, Zwitserland) en NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Zwitserland) en 1:5000 gericht op His-tag (Amylet Scientific, Wuhan, China) en β-actine (Proteintech, Wuhan, China).
Verknoping met disuccinimide-suberaat (DSS) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [26].De cellen werden driemaal gewassen met koude PBS en volledig gelyseerd met een naald van 27 gauge in 50 µl ASC-reactiebuffer (pH 8,0) die 25 mM Na2P04, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES en 125 mM NaHC03 bevatte.Het mengsel werd 3 minuten bij 5000 g gecentrifugeerd en de pellet werd gedurende 30 minuten bij 37°C gehecht met 10 µl DSS (25 mM in DMSO) en 40 µl ASC-reactiebuffer.Na 10 minuten centrifugeren bij 5000 g werd de pellet opgelost in een oplossing van 40 µl ASC-reactiebuffer en 10 µl 6x eiwitlaadbuffer (TransGen, Beijing, China), en vervolgens werd de oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geblust. min., Kook vervolgens 10 minuten.Eiwitmonsters werden vervolgens onderworpen aan Western-blotting met behulp van primaire anti-ASC-antilichamen (Wanleibio, Shenyang, China) bij een verdunningsverhouding van 1:500.
Volgens een eerder beschreven procedure [13] werden celkweeksupernatanten geoogst en werd de secretie van het pro-inflammatoire cytokine IL-1β bepaald met behulp van de muis IL-1 Beta ELISA-kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Converteer OD450nm-waarden naar eiwitconcentraties met behulp van de IL-1β-standaardcurve.
Cellen gecoat op dekglaasjes werden voorzichtig 3 keer gewassen in warme PBS, gefixeerd in weefselcelfixeermiddel (Biosharp, Beijing, China) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT), in 0,1% Triton X-Permeabilize bij 100 (verdund in PBS; Biosharp ) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en blokkeer 5% runderserumalbumine (in PBS) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.De cellen werden vervolgens overnacht bij 4°C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen respectievelijk ASC (verdunning 1:100) of NLRP3 (verdunning 1:100), en Cy3-gelabeld geit-anti-konijn IgG(H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, VS) of FITC-geconjugeerd geit-anti-muis IgG (1:400; Earthox) gedurende een nacht bij 37 ° C in het donker gedurende 1 uur.De kernen werden 5 minuten gekleurd met Hoechst 33258 (10 μg / ml; UE, Suzhou, China) en waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Muizen werden verdeeld in vier groepen (n = 7 in elke groep): (i) Met PBS behandelde negatieve controlegroep (alleen PBS; sondevoeding 100 µl/muis PBS gevolgd door dagelijkse intraperitoneale injectie 100 µl/muis PBS 3 uur later)., continu gedurende 7 dagen);(ii) negatieve controlegroep behandeld met MCC950-remmer [27] (100 µl/muis via PBS-sonde, 3 uur later, 10 mg/kg lichaamsgewicht [BW] MCC950 [in PBS] werd dagelijks intraperitoneaal toegediend, duur 7 dagen);(iii) G. duodenalis cyste-infectiegroep (1,5 x 106 cysten/muis via sondevoeding, 3 uur later, 100 μl/muis PBS dagelijks intraperitoneaal toegediend gedurende 7 dagen);(iv) G. duodenalis cyste gecombineerde infectiegroep MCC950-remmerbehandelingsgroep (1,5 x 106 cysten/muis via maagsonde, 10 mg/kg lichaamsgewicht MCC950 intraperitoneaal dagelijks gedurende 7 dagen om 3 uur).Het lichaamsgewicht van elke muis werd dagelijks gevolgd en alle muizen werden op de zevende dag geëuthanaseerd.Het geoogste duodenum (3 cm lang) werd in kleine stukjes gesneden in 1 ml PBS, de cysten werden overnacht vernietigd in PBS bij 4°C, en trofozoïeten van G. duodenalis.Vers duodenum (1 cm lang) werd geïsoleerd voor kleuring met hematoxyline en eosine (H&E).
Muizen werden verdeeld in twee groepen: (i) MOCK-controlegroep en (ii) MCC950-remmergroep.Er waren vijf behandelingen in elke groep (n = 7/behandelingsgroep): (i) PBS-behandeling negatieve controlegroep (alleen PBS; 100 µl/muis PBS, intramusculaire (IM) injectie (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plasmide-negatieve controlegroep (100 µg/muis-DNA, via intramusculaire injectie); (iii) G. duodenalis cyste-infectie positieve controlegroep (1,5 x 106 cysten/muis, via maagsonde) (iv) a groep behandeld met plasmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/muis-DNA, door intramusculaire injectie), en (v) een groep behandeld met plasmide pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/muis Na 12 uur passage kregen muizen in de MCC950-remmergroep een dagelijkse intraperitoneale injectie van MCC950 (10 mg/kg lichaamsgewicht) gedurende 7 dagen, terwijl muizen in de MOCK-groep een gelijk volume PBS-behandeling kregen. Bloedmonsters werden verzameld uit de oogbolmuizen en een nacht bij 4 ° C bewaard. Serummonsters werden geïsoleerd met behulp van enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) voor en metingen van IL-1β-niveaus.
Vijfendertig muizen werden verdeeld in vijf groepen (n=7/groep).Groep 1 was een negatieve controlegroep die werd behandeld met PBS: muizen ontvingen 100 μl PBS intramusculair en 3 dagen later via maagsonde.Groep 2 is een positieve controlegroep die is geïnfecteerd met cysten van G. duodenalis: muizen werden geïnjecteerd met 100 μl PBS en 3 dagen later werden 1,5 x 106 cysten/muis intragastrisch geïnjecteerd.Derde groep – plasmide-immunisatie met pcDNA3.1(+) in combinatie met een controlegroep voor infectie van duodenale cysten: muizen ontvingen 100 μg plasmide-DNA pcDNA3.1(+)(im) oraal, 1,5×106 cysten/muis 3 voor verschillende dagen.Groepen 4 en 5 waren recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardineplasmide of pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardineplasmide in combinatie met G. duodenalis cyste-infectie.Experimentele groep: muizen ontvingen 100 µg pcDNA3.1(+)-giardine-plasmide-DNA (im), en vervolgens 3 dagen later werden 1,5 x 106 cysten/muis geïnjecteerd via maagsonde.Het lichaamsgewicht van elke muis werd gevolgd na het inbrengen van de G. duodenalis-cyste door de buis.Vers duodenum werd verzameld voor metingen van parasitaire belasting en analyse van HE-kleuring.
Histopathologische veranderingen werden geanalyseerd volgens een eerder gepubliceerde procedure [30].Vers duodenum werd gefixeerd met weefselcelfixeermiddel, ingebed in paraffine, in secties van 4 μm gesneden, gekleurd met H&E en geanalyseerd onder een lichtmicroscoop.Representatieve pathologische veranderingen in zeven weefselcoupes van zeven onafhankelijke muizen werden geëvalueerd door een patholoog die niet op de hoogte was van de behandeling en werden vastgelegd met een vergroting van 200x.De lengte van de villi en de diepte van de crypten werden gemeten volgens de eerder beschreven methoden.
De resultaten in vitro en in vivo werden in drievoud verkregen.Grafieken werden gegenereerd met behulp van GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, VS).Verschillen tussen twee groepen werden geanalyseerd met behulp van t-test, terwijl verschillen tussen ≥3 groepen werden geanalyseerd door middel van eenwegsvariantieanalyse (ANOVA) met behulp van SPSS-software (versie 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, VS).Gegevens werden geanalyseerd op homogeniteit van variantie met behulp van Levene's test gevolgd door Bonferroni's post hoc test (B).De significantie wordt uitgedrukt als P<0,05, P<0,01 en P<0,001 (niet significant [ns]) (P>0,05).
Onze eerdere analyse van GEV-proteomics in de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) toonde aan dat veel doelwitten mogelijk betrokken zijn bij de activering van inflammatoire signaalroutes [13].We hebben twee veelbelovende doelwitten geselecteerd, alfa-2 en alfa-7.3 giardins, amplificeren deze moleculen en gebruiken ze om de pcDNA3.1(+) eukaryotische expressievector te construeren.Na sequencing werden recombinante pcDNA3.1(+)-alpha-2 en alfa-7.3 giardine-expressieplasmiden getransfecteerd in primaire peritoneale macrofagen van muizen, en werd het caspase-1 p20 kenmerkende ontstekingseiwit (een fragment van geactiveerde caspase-1) geïdentificeerd. als het ophelderen van sleutelmoleculen die ontstekingen kunnen veroorzaken.De resultaten toonden aan dat alfa-2- en alfa-7.3-giardines p20-caspase-1-expressie kunnen induceren, vergelijkbaar met GEV.Er werd geen effect op caspase-1-activering gevonden in de onbehandelde negatieve controle (alleen PBS) en plasmidecontrole pcDNA3.1(+) (Figuur 1).
Meting van p20-caspase-1-activering door pcDNA3.1(+)-alpha-2 en alpha-7.3 giardins.Recombinante eukaryote expressieplasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 en alfa-7.3 giardines (boven elke baan) werden getransfecteerd in primaire peritoneale macrofagen van muizen en de supernatanten van de cultuur werden 24 uur later geoogst.Western-blotting werd gebruikt om de expressieniveaus van het kenmerkende caspase-1 p20-inflammasoomeiwit te meten.De behandelingsgroep met alleen PBS (laan C) en de pcDNA3.1(+) monotherapiegroep (pcDNA3.1-laan) werden gebruikt als negatieve controle, en de GEV-behandelingsgroep werd gebruikt als positieve controle.Expressie van het recombinante eiwit werd bevestigd door het detecteren van een histidine-tag in elk eiwit, en de verwachte eiwitbanden waren alfa-2-giardine (38,2 kDa) en alfa-7,3-giardine (37,2 kDa).GEV, Giardia duodenum extracellulaire blaasjes, pcDNA3.1(+), EcoRV-gelineariseerde vector, SUP, supernatant
Om te bepalen of alfa-2 giardine en alfa-7.3 giardine p20 caspase-1-expressie induceren en een rol spelen bij het activeren van de NLRP3-ontstekingsreactie van de gastheer, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine en pcDNA3.1(+)-alpha -7,3 Giardin werd getransfecteerd in primaire peritoneale macrofagen van muizen met recombinant plasmide-DNA, en niveaus van expressie, lokalisatie en oligomerisatie van de belangrijkste ontstekingseiwitten NLRP3 werden bepaald.In dit experiment werd GEV gebruikt als de positieve controlegroep, en de groep zonder behandeling (alleen PBS) of de pcDNA3.1(+) transfectiebehandelingsgroep was de negatieve groep.De resultaten toonden aan dat, net als in de GEV-groep, recombinant plasmide-DNA van giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 en giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 resulteerde in opregulatie van NLRP3, pro-IL-1β en activering van procaspase-1 en caspase-1 (Fig. 2a).Bovendien induceerden beide giardines significante IL-1β-secretie (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figuur 2b).De meeste ASC-eiwitten waren monomeer in de groep zonder behandeling of in de behandelde groep getransfecteerd met het pcDNA3.1(+)-plasmide, in tegenstelling tot pcDNA3.1(+)-alpha-2 of pcDNA3.1(+)-alpha-2. 7,3 giardine.ASC-oligomerisatie vond plaats in het recombinante plasmide-DNA van de GEV-positieve controlegroep of -groep, en vertoonde een oligomere vorm (Figuur 2c).Deze voorlopige gegevens suggereren dat alfa-2-giardine en alfa-7,3-giardine NLRP3-ontstekingsactivatie kunnen induceren.Daaropvolgende immunofluorescentiestudies naar de lokalisatie van ASC en NLRP3 toonden aan dat in de negatieve controlegroep het ASC-eiwit verspreid was door het cytoplasma en als een puntsignaal verscheen na stimulatie van pcDNA3.1(+)-alpha-2 met giardine of pcDNA3.1(+)-alfa-7,3-giardinegroep of GEV-positieve controlegroep (Figuur 2d).In de negatieve controle- en met plasmide behandelde pcDNA 3.1-groepen werd het NLRP3-eiwitsignaal niet gedetecteerd, terwijl er een fluorescerend signaalpunt verscheen als reactie op pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine of pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 was gedetecteerd..giardine wordt aangetroffen in het cytoplasma of bij stimulatie van de HEV (Fig. 2e).Deze gegevens tonen verder aan dat G. duodenalis giardin alpha-2 en giardin alpha-7.3 het NLRP3-inflammasoom activeren in primaire peritoneale macrofagen van muizen.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin en pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin activeren het NLRP3-inflammasoom in peritoneale macrofagen van muizen.Transfecteer de recombinante eukaryote expressieplasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin en pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin in primaire muizen peritoneale macrofagen en cellen, of oogst het supernatant binnen 24 uur voor analyse van expressie, oligomerisatie , secretie.en lokalisatie van belangrijke ontstekingseiwitten.De groep met alleen PBS (C) en de pcDNA3.1(+)-groep met enkele behandeling werden gebruikt als de negatieve controle, en de GEV-behandelingsgroep werd gebruikt als de positieve groep.a Belangrijke ontstekingseiwitten NLRP3, waaronder NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 en p20 caspase-1, werden gedetecteerd door Western-blotting.b De niveaus van secretie van IL-1β in de bovenstaande vloeistoffen werden bepaald met behulp van enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA).Verschillen tussen controle- en experimentele groepen werden geanalyseerd door middel van eenwegsvariantieanalyse (ANOVA) met behulp van SPSS-softwareversie 22.0.Sterretjes geven significante verschillen aan tussen de groepen **P<0,01 en ***P<0,001.c ASC-oligomerisatieniveaus in pellets werden bepaald door DSS-verknopingsanalyse, terwijl ASC-niveaus in cellysaten werden gebruikt als beladingscontrole.d Visualisatie van ISC-lokalisatie met behulp van immunofluorescentie.e Immunofluorescentie werd gebruikt om de lokalisatie van NLRP3 te visualiseren.ASC, apoptotisch vlekachtig eiwit;IL, interleukine;NLRP3, nucleotide-bindende oligomerisatie-achtige receptor 3;ns, niet significant (P > 0,05)
Zowel G. duodenalis als de GEV's die het uitscheidt, activeren het NLRP3-inflammasoom en reguleren de ontstekingsreacties van de gastheer in vitro.De rol van het NLRP3-inflammasoom in de pathogeniteit van G. duodenalis blijft dus onduidelijk.Om dit probleem te onderzoeken, hebben we een experiment ontworpen tussen muizen die waren geïnfecteerd met G. duodenalis-cyste en muizen die waren geïnfecteerd met G. duodenalis-cyste + MCC950-remmerbehandeling en vergeleken we de NLRP3-inflammasoomexpressie bij infectie met G. duodenalis-cyste.Een gedetailleerd schema van het experiment wordt getoond in figuur 3a.Veranderingen in lichaamsgewicht van muizen in verschillende behandelingsgroepen werden gedurende 7 dagen na infectie met cysten gevolgd en de resultaten worden getoond in figuur 3b.Vergeleken met de groep behandeld met zuivere PBS toonden de resultaten aan dat (i) het lichaamsgewicht van muizen geïnfecteerd met G. duodenalis cyste afnam van dag 3 tot dag 7 na infectie;(ii) behandeling met de MCC950-remmer had geen significant effect op het lichaamsgewicht van de muizen..Vergeleken met de groep met enkele infectie nam de BW van de groep met duodenale infectie behandeld met MCC950 in verschillende mate af (Dag 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Dag 2: ANOVA, F(3, 24). ) = 0,4602, P<0,0001; Dag 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; Dag 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Dag 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; Dag 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Deze gegevens tonen aan dat het NLRP3-inflammasoom muizen beschermt tegen aanzienlijk gewichtsverlies in de vroege stadia (2-4 dagen) van duodenale infectie.Vervolgens probeerden we G. duodenalis trofozoïeten te detecteren in duodenale lavagevloeistof en de resultaten worden getoond in figuur 3c.Vergeleken met de G. duodenalis cyste-infectiegroep nam het aantal trofozoïeten in de twaalfvingerige darm significant toe na blokkering van het NLRP3-inflammasoom (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Duodenale weefsels gekleurd met HE vertoonden, vergeleken met negatieve controle behandeld met alleen PBS en MCC950: (i) G. duodenalis cyste-infectie resulteerde in schade aan de duodenale villi (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) en crypte-atrofie (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) twaalfvingerige darm van muizen geïnfecteerd met G. duodenalis-cysten en behandeld met MCC950-remmers.duodenale villi waren beschadigd en dood (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) met atrofie en cryptevertakking (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- F) .Deze resultaten suggereren dat het NLRP3-inflammasoom een ​​rol speelt bij het verminderen van de pathogeniteit van G. duodenalis.
Rol van NLRP3-inflammasoom bij Giardia duodenum-infectie.Muizen werden via een maagsonde (iv) voorzien van duodenokokkencysten en vervolgens behandeld met of zonder MCC950 (ip).Enkelvoudige behandelingsgroepen met PBS of MCC950 werden als controles gebruikt.Experimentele groep en behandelingsregime.b Het lichaamsgewicht van muizen in elk van de verschillende behandelingsgroepen werd gedurende 7 dagen gevolgd.Het verschil tussen de G. duodenalis-infectiegroep en de G. duodenalis + MCC950-infectiebehandelingsgroep werd geanalyseerd met een t-test met behulp van SPSS-softwareversie 22.0.Sterretjes geven significante verschillen aan bij *P<0,05, **P<0,01 of ***P<0,001.c De parasitaire belasting werd bepaald door het aantal trofozoïeten in de duodenale lavagevloeistof te tellen.Het verschil tussen de G. duodenalis-infectiegroep en de G. duodenalis + MCC950-infectiebehandelingsgroep werd geanalyseerd met een t-test met behulp van SPSS-softwareversie 22.0.Sterretjes geven significante verschillen aan bij *P <0,05.d Hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuringsresultaten van histopathologie van de twaalfvingerige darm.Rode pijlen geven schade aan de villi aan, groene pijlen duiden schade aan de crypten aan.Schaalbalk: 100 µm.e, f Statistische analyse van de hoogte van de duodenale villus en de hoogte van de muizencrypte.Sterretjes geven significante verschillen aan bij *P<0,05 en **P<0,01.De resultaten zijn afkomstig van 7 onafhankelijke biologische experimenten.BW, lichaamsgewicht;ig, intragastrische toedieningsroute;ip, intraperitoneale toedieningsroute;ns, niet significant (P > 0,05);PBS, fosfaatgebufferde zoutoplossing;WT, wildtype
De uitscheiding van IL-1β is een kenmerk van ontstekingsactivatie.Om te bepalen of G. duodenalis alfa-2 giardine en alfa-7.3 giardine het NLRP3-gastheer-inflammasoom in vivo activeren, gebruikten we onbehandelde WT-muizen (schijngroep) en NLRP3-inflammasoom-geblokkeerde muizen (MCC950-geremde behandelingsgroep).Een gedetailleerd schema van het experiment wordt getoond in figuur 4a.Experimentele groepen bestonden uit muizen behandeld met PBS, G. duodenalis-cystebehandeling door middel van maagsonde, intramusculaire injectie van pcDNA3.1 en intramusculaire injectie van pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardine of pcDNA3.1-alpha-7.3-giardine.Op de zevende dag na intramusculaire toediening van het recombinante plasmide werd serum verzameld en werd het niveau van IL-1β in elke groep bepaald.Zoals weergegeven in Figuur 4b, had in de MOCK-groep: (i) vergeleken met de PBS-groep behandeling met pcDNA3.1 geen significant effect op de IL-1β-secretie (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), maar De IL-β-secretie was significant verhoogd in de cystegroep van G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine en pcDNA3.1- Intramusculaire injectie van alfa-7.3-giardine verhoogde de serum-IL-1β-waarden significant (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3-giardine induceerde hoge niveaus van IL-1β-secretie in de pcDNA3.1-alpha-2-giardine intramusculaire injectiegroep (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Vergeleken met elke groep in de MCC950-behandelingsgroep en de MOCK-groep: (i) daalden de IL-1β-secretieniveaus in de PBS-controlegroep en de pcDNA3.1-controlegroep tot op zekere hoogte na het blokkeren van de MCC950-remmer, maar het verschil was niet groter. significant (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) na het blokkeren van MCC950.was de IL-1β-secretie significant verminderd in de met G. duodenalis cyste geïnfecteerde groep, de pcDNA3.1-alpha-2 giardine-groep en de pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine-groep (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alfa-2-giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-alfa-7,3-giardine: ANOVA, F(9, 58; ) = 3,540, P = 0,0164).Deze resultaten suggereren dat alfa-2-giardine en alfa-7.3-giardine de activering van het NLRP3-inflammasoom in vivo mediëren.
pcDNA3.1(+)-giardines activeren het NLRP3-gastheer-inflammasoom in vivo.Muizen werden geïmmuniseerd (IM) met recombinant eukaryotisch expressieplasmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine of pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine en vervolgens behandeld met MCC950 (ip; MCC950-groep) of niet (dummygroep). ).De PBS- of pcDNA3.1(+)-plasmidebehandelingsgroep werd gebruikt als een negatieve controle, de G. duodenalis-cystebehandelingsgroep werd gebruikt als een positieve controle.Experimentele groep en behandelingsregime.b Serumniveaus van IL-1β bij muizen werden op dag 7 gemeten met behulp van ELISA-test.Verschillen tussen groepen in de MOCK-groep werden geanalyseerd met behulp van one-way ANOVA, en verschillen tussen de MOCK-groep en de MCC950-groep werden geanalyseerd met behulp van de t-test van SPSS-softwareversie 22.0.Sterretjes geven significante verschillen aan tussen behandelingsgroepen in de MOCK-groep, *P<0,05 en ***P<0,001;dollartekens ($) duiden op significante verschillen tussen elke groep in de MOCK-groep en de MCC950-groep bij P <0,05.Resultaten van zeven onafhankelijke biologische experimenten.i, intramusculaire injectie, ns, niet significant (P > 0,05)
Om het effect van door alfa-2 en alfa-7.3-giardine gemedieerde activering van het NLRP3-gastheerontstekingsmasker op de infectiviteit van G. duodenalis te onderzoeken, hebben we WT C57BL/6-muizen gebruikt en alfa-2-giardine en alfa-7.3-giardine geïnjecteerd.het plasmide werd na 3 dagen intramusculair geïnjecteerd via de maagsonde van de cyste van G. duodenalis, waarna de muizen gedurende 7 dagen werden geobserveerd.Een gedetailleerd schema van het experiment wordt getoond in figuur 5a.Het lichaamsgewicht van elke muis werd elke dag gemeten, monsters van vers twaalfvingerige darmweefsel werden verzameld op de 7e dag na toediening via een maagsonde, het aantal trofozoïeten werd gemeten en histopathologische veranderingen werden waargenomen.Zoals weergegeven in figuur 5b nam bij toenemende voedertijd de BW van muizen in elke groep geleidelijk toe.De MT van muizen begon af te nemen op de derde dag na intragastrische toediening van G. duodenalis-cysten, en nam vervolgens geleidelijk toe.Activering van het NLRP3-inflammasoom geïnduceerd door intramusculaire injectie van alfa-2-giardine en alfa7.3-giardine verzwakte het gewichtsverlies bij muizen aanzienlijk (Dag 1: pcDNA3.1-alpha-2-giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Dag 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Dag 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Dag 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; Dag 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dag 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083; Dag 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dag 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Dag 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dag 5: pcDNA3.1-alpha -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dag 6: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, dag 6: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dag 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Dag 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).De parasitaire belasting werd beoordeeld in de twaalfvingerige darm (figuur 5c).Vergeleken met de onbehandelde positieve controle en de groep geïnjecteerd met de lege pcDNA3.1-vector, was het aantal G. duodenalis trofozoïeten significant verminderd in de groepen geïnjecteerd met α-2 giardine en α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha -2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Bovendien was giardine alfa-7.3 meer beschermend bij muizen dan giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).De resultaten van HE-kleuring worden getoond in Fig.5d – f.Muizen geïnjecteerd met alfa-2 giardine en alfa-7.3 giardine hadden minder weefsellaesies in de twaalfvingerige darm, gemanifesteerd door villusschade, vergeleken met muizen geïnjecteerd met G. duodenalis en muizen geïnjecteerd met G. duodenalis in combinatie met een lege pcDNA3-vector .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 of P = 0,0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 of P = 0,0055) en verminderde crypte-atrofie (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 of P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 of P = 0,0191).Deze resultaten suggereren dat alfa-2-giardine en alfa-7,3-giardine de infectiviteit van G. duodenalis verminderen door het NLRP3-inflammasoom in vivo te activeren.
Rol van pcDNA3.1(+)-giardins bij G. duodenalis-infectie.Muizen werden geïmmuniseerd (IM) met recombinante eukaryotische expressieplasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine of pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine en vervolgens geprikkeld met G. duodenalis-cysten (ig).De PBS-groep en de pcDNA3.1(+) + duodenale cyste-behandelingsgroep werden gebruikt als negatieve controlegroepen, en de duodenale cyste-behandelingsgroep werd gebruikt als positieve controlegroep.Experimentele groep en behandelingsregime.b De MT van muizen in elk van de verschillende behandelingsgroepen werd gedurende 7 dagen na de uitdaging gevolgd.Sterretjes geven significante verschillen aan tussen groepen in de G. duodenalis-groep en de pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine-groep, *P < 0,05, **P < 0,01 en ***P < 0,001;het dollarteken ($) geeft een significant verschil aan tussen elke groep van G. duodenalis en de pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine-groep, $$P<0,01 en $$$P<0,001.c De parasitaire belasting werd bepaald door het aantal trofozoïeten te tellen in 1 ml duodenale lavage van de twaalfvingerige darm (3 cm lang) en uitgedrukt als het aantal parasieten per cm twaalfvingerige darm.Verschillen tussen de G. duodenalis-infectiegroep, de pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine-groep en de pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine-groep werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA met behulp van SPSS-softwareversie 22.0.Sterretjes geven significante verschillen aan bij **P<0,01 en ***P<0,001.d Histopathologische veranderingen in de twaalfvingerige darm.Rode pijlen geven schade aan de villi aan, groene pijlen duiden schade aan de crypten aan.Schaalbalk: 100 µm.e, f Statistische analyse van de hoogte van de twaalfvingerige darmvillus van muizen (e) en cryptehoogte (f).Verschillen tussen groepen in figuur 1d werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA met behulp van SPSS-softwareversie 22.0.Sterretjes geven significante verschillen aan bij *P<0,05 en **P<0,01.Resultaten van zeven onafhankelijke biologische experimenten.ns, niet significant (P > 0,05)
Giardia duodenum is een bekende darmparasiet van mensen en andere zoogdieren die giardiasis veroorzaakt.In 2004 werd het opgenomen in het WHO Neglected Diseases Initiative vanwege de hoge prevalentie ervan gedurende zes jaar, vooral in gemeenschappen met een lage sociaal-economische status [32].Het aangeboren immuunsysteem speelt een cruciale rol in de immuunrespons op G. duodenalis-infectie.Er is gerapporteerd dat muizenmacrofagen G. duodenalis overspoelen en doden door extracellulaire vallen vrij te geven [33].Onze eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat G. duodenalis, een niet-invasieve extracellulaire parasiet, p38 MAPK, ERK, NF-KB p65 en NLRP3 inflammatoire signaalroutes in muismacrofagen activeert om ontstekingsreacties van de gastheer te reguleren, en vrijgegeven GEV kan dit proces versterken.13], 24].De exacte PAMP's die betrokken zijn bij NLRP3-inflammasoom-gereguleerde ontstekingen in GEV en de rol van NLRP3-inflammasoom bij giardiasis moeten echter nog worden opgehelderd.Om licht te werpen op deze twee vragen hebben wij dit onderzoek uitgevoerd.
Het NLRP3-inflammasoom bevindt zich in het cytoplasma van immuuncellen en kan worden geactiveerd door verschillende deeltjes zoals urinezuurkristallen, toxines, bacteriën, virussen en parasieten.In bacteriële onderzoeken zijn toxinen geïdentificeerd als belangrijke PAMP’s die ontstekingssensoren activeren, wat leidt tot ontstekingen en celdood [34].Sommige structureel diverse toxinen, zoals hemolysine van Staphylococcus aureus [35] en Escherichia coli [36], hemolysine BL (HBL) van enterotoxine (NHE) [37], induceren de activering van NLRP3-ontsteking.Virale onderzoeken hebben aangetoond dat virulentie-eiwitten zoals SARS-COV-2 envelop (E)-eiwit [38] en Zika-virus NS5-eiwit [39] belangrijke PAMP’s zijn die worden herkend door de NLRP3-receptor.In parasietstudies is gemeld dat veel parasieten geassocieerd zijn met ontstekingsactivatie van de gastheer, zoals Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] en Leishmania [42].De dichte korreleiwitten GRA35, GRA42 en GRA43, geassocieerd met de virulentie van Toxoplasma gondii, zijn vereist voor de inductie van pyroptose in macrofagen van Lewis-ratten [43].Bovendien hebben sommige Leishmania-onderzoeken zich gericht op individuele moleculen die betrokken zijn bij het NLRP3-inflammasoom, zoals parasietmembraan lipofosfoglycaan [44] of zinkmetalloprotease [45].Van de annexine-achtige alfa-giardine-genenfamilie is in een muismodel aangetoond dat alfa-1-giardine een potentiële vaccinkandidaat is die bescherming biedt tegen G. duodenalis [18].In onze studie hebben we de virulentiefactoren alfa-2 en alfa-7,3 van G. duodenalis geselecteerd, die uniek zijn voor giardia maar relatief minder gerapporteerd worden.Deze twee doelgenen werden gekloneerd in de pcDNA3.1(+) eukaryotische expressiesysteemvector voor analyse van ontstekingsactivatie.
In ons muismodel dienen gesplitste caspasefragmenten als markers van ontstekingsactivatie.Na stimulatie interageert NLRP3 met ASC, recruteert procaspasen en genereert actieve caspasen die pro-IL-1β en pro-IL-18 splitsen in respectievelijk volwassen IL-1β en IL-18.Inflammatoire caspasen (caspases-1, -4, -5 en -11) zijn een geconserveerde familie van cysteïneproteasen die cruciaal zijn voor de aangeboren afweer en betrokken zijn bij ontstekingen en geprogrammeerde celdood [46].Caspase-1 wordt geactiveerd door canonieke inflammasomen [47], terwijl caspasen-4, -5 en -11 worden gesplitst tijdens de vorming van atypische inflammasomen [48].In deze studie gebruikten we peritoneale macrofagen van muizen als model en onderzochten we p20 caspase-1-gesplitste caspase-1 als een marker voor gastheer-NLRP3-ontstekingsactivatie in onderzoeken naar G. duodenalis-infectie.De resultaten toonden aan dat veel alfa-giardines verantwoordelijk zijn voor de typische activering van ontstekingen, wat consistent is met de ontdekking van belangrijke virulentiemoleculen die betrokken zijn bij bacteriën en virussen.Onze studie is echter slechts een voorlopige screening en er zijn andere moleculen die niet-klassieke inflammasomen kunnen activeren, aangezien onze vorige studie zowel klassieke als niet-klassieke inflammasomen aantrof bij G. duodenalis-infectie [13].Om verder te bepalen of de gegenereerde p20-caspase-1 geassocieerd is met het NLRP3-inflammasoom, hebben we alfa-2- en alfa-7.3-giardins getransfecteerd in peritoneale macrofagen van muizen om de expressieniveaus van sleutelmoleculeneiwitten en ASC-oligomerisatieniveaus te bepalen, wat bevestigt dat beide α-giardines activeren inflammasoom NLRP3.Onze resultaten verschillen enigszins van die van Manko-Prykhoda et al., die rapporteerden dat stimulatie van Caco-2-cellen met alleen G. muris- of E. coli EPEC-stammen de fluorescentie-intensiteit van NLRP3, ASC en caspase-1 kan verhogen. hoewel niet significant, terwijl co-stimulatie van G. muris en E. coli de niveaus van drie eiwitten verhoogde [49].Deze discrepantie kan te wijten zijn aan verschillen in de selectie van Giardia-soorten, cellijnen en primaire cellen.We hebben ook in vivo testen uitgevoerd met behulp van MCC950 bij 5 weken oude vrouwelijke WT C57BL/6 muizen, die gevoeliger zijn voor G. duodenalis.MCC950 is een krachtige en selectieve NLRP3-remmer met een klein molecuul die canonieke en niet-canonieke NLRP3-activering bij nanomolaire concentraties blokkeert.MCC950 remt NLRP3-activering, maar heeft geen invloed op de activering van AIM2-, NLRC4- en NLRP1-inflammatoire routes of TLR-signaleringsroutes [27].MCC950 blokkeert NLRP3-activering maar remt NLRP3-initiatie, K+-efflux, Ca2+-influx of de interactie tussen NLRP3 en ASC niet;in plaats daarvan remt het NLRP3-ontstekingsmaskeractivatie door ASC-oligomerisatie te blokkeren [27].Daarom hebben we MCC950 in een in vivo onderzoek gebruikt om de rol van het NLRP3-inflammasoom na giardine-injectie te bepalen.Geactiveerde caspase-1 p10 splitst pro-inflammatoire cytokines pro-IL-1β en pro-IL-18 in volwassen IL-1β en IL-18 [50].In deze studie werden serum IL-1β-niveaus in met giardine behandelde muizen met of zonder MCC950 gebruikt als indicator of het NLRP3-inflammasoom was geactiveerd.Zoals verwacht verminderde de behandeling met MCC950 de serum-IL-1β-waarden aanzienlijk.Deze gegevens tonen duidelijk aan dat G. duodenalis giardin alfa-2 en giardin alfa-7.3 in staat zijn het NLRP3-muizeninflammasoom te activeren.
Significante gegevens verzameld in de afgelopen tien jaar hebben aangetoond dat IL-17A de hoofdregulator is van de immuniteit tegen G. muris, die IL-17RA-signalering induceert, antimicrobiële peptiden produceert en complementactivatie reguleert [51].Giardia-infectie komt echter vaker voor bij jonge volwassenen, en er is gemeld dat Giardia-infectie bij jonge muizen de IL-17A-reactie niet activeert om zijn beschermende effect uit te oefenen [52], wat onderzoekers ertoe aanzet op zoek te gaan naar andere immuunmodulerende Giardia.mechanismen van worminfectie.De auteurs van een recente studie meldden dat G. muris het NLRP3-inflammasoom door E. coli EPEC kan activeren, dat de productie van antimicrobiële peptiden bevordert en het hechtingsvermogen ervan en het aantal trofozoïeten in het darmkanaal vermindert, waardoor de ernst van darmproblemen wordt verminderd. ziekten veroorzaakt door bacillen [49].Het NLRP3-inflammasoom is betrokken bij de ontwikkeling van verschillende ziekten.Studies hebben aangetoond dat Pseudomonas aeruginosa autofagie in macrofagen activeert om celdood te voorkomen, en dit proces hangt af van de activering van het NLRP3-inflammasoom [53].Voor N. caninum beperkt reactieve zuurstofspecies-gemedieerde activering van het NLRP3-inflammasoom de replicatie ervan in de gastheer, waardoor het een potentieel therapeutisch doelwit wordt [9].Er is gevonden dat Paracoccidioides brasiliensis de activering van het NLRP3-inflammasoom induceert in van beenmerg afkomstige dendritische cellen van muizen, resulterend in de afgifte van het inflammatoire cytokine IL-1β, dat een cruciale rol speelt bij de verdediging van de gastheer [10].Verschillende Leishmania-soorten, waaronder L. amazonensis, L. major, L. braziliensis en L. infantum chagasi, activeren NLRP3 en ASC-afhankelijke caspase-1 in macrofagen, evenals Leishmania-infectie.De replicatie van parasieten is verbeterd bij muizen die een tekort hebben aan het NLRP3/ASC/caspase-1-gen [11].Zamboni et al.Er is gerapporteerd dat Leishmania-infectie activering van het NLRP3-inflammasoom in macrofagen induceert, wat de intracellulaire parasietreplicatie beperkt.Leishmania kan dus NLRP3-activering remmen als een vermijdingsstrategie.In in vivo onderzoeken droeg het NLRP3-inflammasoom bij aan de eliminatie van Leishmania, maar had het geen invloed op weefsels [54].Omgekeerd onderdrukte in onderzoeken naar helminthiasis activering van het NLRP3-inflammasoom de beschermende immuniteit van de gastheer tegen gastro-intestinale helminthiasis [12].Shigella is een van de belangrijkste bacteriën die wereldwijd diarree veroorzaakt.Deze bacteriën kunnen de productie van IL-1β induceren via P2X7-receptor-gemedieerde K+-efflux, reactieve zuurstofsoorten, lysosomale verzuring en mitochondriale schade.Het NLRP3-inflammasoom reguleert de fagocytose en bacteriedodende activiteit van macrofagen tegen Shigella negatief [55].Plasmodium-onderzoeken hebben aangetoond dat muizen met AIM2-, NLRP3- of caspase-1-deficiëntie die zijn geïnfecteerd met Plasmodium hoge niveaus van type 1-interferon produceren en resistenter zijn tegen Plasmodium-infectie [56].De rol van alfa-2-giardine en alfa-7.3-giardine bij het induceren van pathogene activering van NLRP3-ontsteking bij muizen is echter onduidelijk.
In deze studie verminderde remming van het NLRP3-inflammasoom door MCC950 de BW en verhoogde het aantal trofozoïeten in de darmspoelingsvloeistof bij muizen, resulterend in ernstiger pathologische veranderingen in het duodenumweefsel.Alfa-2 giardine en alfa-7.3 giardine activeren het NLRP3-inflammasoom van de gastheermuis, verhogen het lichaamsgewicht van de muis, verminderen het aantal trofozoïeten in de darmspoelvloeistof en verlichten pathologische duodenale laesies.Deze resultaten suggereren dat G. duodenalis het NLRP3-gastheerinflammasoom kan activeren via alfa-2 giardine en alfa-7,3 giardine, waardoor de pathogeniteit van G. duodenalis bij muizen wordt verminderd.
Gezamenlijk tonen onze resultaten aan dat alfa-2- en alfa-7.3-giardines de activering van het NLRP3-gastheer-inflammasoom induceren en de infectiviteit van G. duodenalis bij muizen verminderen.Daarom zijn deze moleculen veelbelovende doelwitten voor de preventie van giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: een overzicht.Onlangs werd onthuld dat Pat Inflamm allergisch is voor medicijnen.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: een overzicht van farmacotherapie.Deskundig advies van een apotheker.2007;8: 1885-902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, resistentie tegen geneesmiddelen en de ontdekking van nieuwe doelwitten.Infecteert Disord-drugsdoelen.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, etc. NLRP3 ontstekingsziekten en ontstekingsziekten.Oxide Med-cel Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. De rol van het ontstekingsmasker bij darmontstekingen en kanker.Gastro-enterologie.2011;141: 1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonieke en atypische NLRP3-ontstekingsactivatie op het kruispunt van immuuntolerantie en darmontsteking.pre-immuun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-gemedieerde NLRP3-ontstekingsactivatie is betrokken bij de reactie op N. caninum-infectie.Parasitaire vector.2020;13:449.