Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden wij u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, zullen we de site in de tussentijd weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Genvectoren voor de behandeling van pulmonale cystische fibrose moeten gericht zijn op de geleidende luchtwegen, aangezien perifere longtransductie geen therapeutisch effect heeft.De efficiëntie van virale transductie houdt rechtstreeks verband met de verblijftijd van de drager.Afgiftevloeistoffen zoals gendragers diffunderen echter op natuurlijke wijze in de longblaasjes tijdens het inademen, en therapeutische deeltjes van welke vorm dan ook worden snel verwijderd door mucociliair transport.Het verlengen van de verblijftijd van gendragers in de luchtwegen is belangrijk maar moeilijk te bereiken.Carrier-geconjugeerde magnetische deeltjes die naar het oppervlak van de luchtwegen kunnen worden gericht, kunnen de regionale targeting verbeteren.Als gevolg van problemen met in vivo beeldvorming wordt het gedrag van dergelijke kleine magnetische deeltjes op het luchtwegoppervlak in aanwezigheid van een aangelegd magnetisch veld slecht begrepen.Het doel van deze studie was om synchrotronbeeldvorming te gebruiken om in vivo de beweging van een reeks magnetische deeltjes in de luchtpijp van verdoofde ratten te visualiseren om de dynamiek en gedragspatronen van afzonderlijke en bulkdeeltjes in vivo te bestuderen.Vervolgens hebben we ook beoordeeld of de toediening van lentivirale magnetische deeltjes in de aanwezigheid van een magnetisch veld de efficiëntie van de transductie in de luchtpijp van de rat zou verhogen.Synchrotron-röntgenbeelden tonen het gedrag van magnetische deeltjes in stationaire en bewegende magnetische velden in vitro en in vivo.Deeltjes kunnen niet gemakkelijk met behulp van magneten over het oppervlak van levende luchtwegen worden gesleept, maar tijdens transport worden afzettingen geconcentreerd in het gezichtsveld, waar het magnetische veld het sterkst is.De transductie-efficiëntie werd ook zesvoudig verhoogd wanneer lentivirale magnetische deeltjes werden afgeleverd in de aanwezigheid van een magnetisch veld.Alles bij elkaar suggereren deze resultaten dat lentivirale magnetische deeltjes en magnetische velden waardevolle benaderingen kunnen zijn om de genvectortargeting en transductieniveaus in de geleidende luchtwegen in vivo te verbeteren.
Cystische fibrose (CF) wordt veroorzaakt door variaties in een enkel gen dat de CF transmembraangeleidingsregulator (CFTR) wordt genoemd.Het CFTR-eiwit is een ionkanaal dat aanwezig is in veel epitheelcellen door het hele lichaam, inclusief de luchtwegen, een belangrijke plaats in de pathogenese van cystische fibrose.Defecten in CFTR leiden tot abnormaal watertransport, uitdroging van het luchtwegoppervlak en verminderde diepte van de luchtwegoppervlakvloeistoflaag (ASL).Het schaadt ook het vermogen van het mucociliaire transportsysteem (MCT) om de luchtwegen te zuiveren van ingeademde deeltjes en ziekteverwekkers.Ons doel is om een ​​lentivirale (LV) gentherapie te ontwikkelen om de juiste kopie van het CFTR-gen af ​​te leveren en de ASL-, MCT- en longgezondheid te verbeteren, en om door te gaan met het ontwikkelen van nieuwe technologieën die deze parameters in vivo kunnen meten1.
LV-vectoren zijn een van de belangrijkste kandidaten voor gentherapie voor cystische fibrose, vooral omdat ze het therapeutische gen permanent kunnen integreren in basale cellen van de luchtwegen (luchtwegstamcellen).Dit is belangrijk omdat ze de normale hydratatie en slijmopruiming kunnen herstellen door te differentiëren in functionele gen-gecorrigeerde luchtwegoppervlaktecellen geassocieerd met cystische fibrose, wat resulteert in levenslange voordelen.LV-vectoren moeten tegen de geleidende luchtwegen worden gericht, omdat dit het punt is waar de betrokkenheid van de longen bij CF begint.Afgifte van de vector dieper in de long kan resulteren in alveolaire transductie, maar dit heeft geen therapeutisch effect bij cystische fibrose.Vloeistoffen zoals gendragers migreren echter op natuurlijke wijze naar de longblaasjes wanneer ze na de bevalling worden ingeademd3,4 en therapeutische deeltjes worden door MCT's snel in de mondholte verdreven.De efficiëntie van LV-transductie houdt rechtstreeks verband met de tijdsduur dat de vector dicht bij de doelcellen blijft om cellulaire opname mogelijk te maken – de ‘verblijfstijd’ 5 die gemakkelijk wordt verkort door de typische regionale luchtstroom en door gecoördineerde opname van slijm en MCT-deeltjes.Voor cystische fibrose is het vermogen om de verblijftijd van LV in de luchtwegen te verlengen belangrijk om hoge transductieniveaus in dit gebied te bereiken, maar dit is tot nu toe een uitdaging geweest.
Om deze hindernis te overwinnen, stellen we voor dat LV-magnetische deeltjes (MP's) op twee complementaire manieren kunnen helpen.Ten eerste kunnen ze door een magneet naar het luchtwegoppervlak worden geleid om de doelgerichtheid te verbeteren en ervoor te zorgen dat gendragerdeeltjes zich in het juiste deel van de luchtwegen bevinden;en ASL) verplaatsen zich naar cellaag 6. MP's worden veel gebruikt als gerichte medicijnafgiftevehikels wanneer ze binden aan antilichamen, chemotherapiemedicijnen of andere kleine moleculen die zich hechten aan celmembranen of binden aan hun respectievelijke celoppervlakreceptoren en zich ophopen op tumorplaatsen in aanwezigheid van statische elektriciteit.Magnetische velden voor kankertherapie 7. Andere “hyperthermische” methoden zijn gericht op het doden van tumorcellen door MP's te verwarmen wanneer ze worden blootgesteld aan oscillerende magnetische velden.Het principe van magnetische transfectie, waarbij een magnetisch veld wordt gebruikt als transfectiemiddel om de overdracht van DNA naar cellen te verbeteren, wordt in vitro algemeen gebruikt met behulp van een reeks niet-virale en virale genvectoren voor moeilijk te transduceren cellijnen. ..De efficiëntie van LV-magnetotransfectie met de afgifte van LV MP in vitro in een cellijn van menselijk bronchiaal epitheel in aanwezigheid van een statisch magnetisch veld werd vastgesteld, waardoor de efficiëntie van transductie 186 keer toenam in vergelijking met de LV-vector alleen.LV MT is ook toegepast op een in vitro model van cystische fibrose, waarbij magnetische transfectie de LV-transductie in lucht-vloeistof grensvlakculturen met een factor 20 verhoogde in de aanwezigheid van cystische fibrose sputum10.In vivo orgaanmagnetotransfectie heeft echter relatief weinig aandacht gekregen en is slechts in enkele dierstudies geëvalueerd11,12,13,14,15, vooral in de longen16,17.De mogelijkheden van magnetische transfectie bij longtherapie bij cystische fibrose zijn echter duidelijk.Tan et al.(2020) stelden dat “een validatiestudie naar effectieve pulmonale afgifte van magnetische nanodeeltjes de weg zal vrijmaken voor toekomstige CFTR-inhalatiestrategieën om de klinische resultaten bij patiënten met cystische fibrose te verbeteren”6.
Het gedrag van kleine magnetische deeltjes op het oppervlak van de luchtwegen in aanwezigheid van een aangelegd magnetisch veld is moeilijk te visualiseren en te bestuderen, en daarom worden ze slecht begrepen.In andere onderzoeken hebben we een op Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI)-methode ontwikkeld voor niet-invasieve beeldvorming en kwantificering van minieme in vivo veranderingen in ASL18-diepte en MCT19-gedrag,20 om de hydratatie van het gaskanaaloppervlak direct te meten. en wordt gebruikt als een vroege indicator voor de effectiviteit van de behandeling.Bovendien maakt onze MCT-scoringsmethode gebruik van deeltjes met een diameter van 10-35 µm, samengesteld uit aluminiumoxide of glas met een hoge brekingsindex, als MCT-markers zichtbaar met PB-PCXI21.Beide methoden zijn geschikt voor het afbeelden van een reeks deeltjestypen, waaronder MP's.
Vanwege de hoge ruimtelijke en temporele resolutie zijn onze op PB-PCXI gebaseerde ASL- en MCT-tests zeer geschikt om de dynamiek en gedragspatronen van afzonderlijke en bulkdeeltjes in vivo te bestuderen om ons te helpen de methoden voor het afleveren van MP-genen te begrijpen en te optimaliseren.De aanpak die we hier gebruiken is gebaseerd op onze onderzoeken met behulp van de SPring-8 BL20B2-bundellijn, waarin we vloeiende bewegingen visualiseerden na toediening van een dosis van een dummy-vector in de nasale en longluchtwegen van muizen om onze waargenomen heterogene genexpressiepatronen te helpen verklaren in ons gen.dierstudies met een dragerdosis van 3,4.
Het doel van deze studie was om de PB-PCXI-synchrotron te gebruiken om in vivo bewegingen van een reeks MP's in de luchtpijp van levende ratten te visualiseren.Deze PB-PCXI-beeldvormingsstudies waren bedoeld om de MP-serie, de magnetische veldsterkte en de locatie te testen om hun effect op de MP-beweging te bepalen.We gingen ervan uit dat een extern magnetisch veld de afgeleverde MF zou helpen om naar het doelgebied te blijven of te bewegen.Dankzij deze onderzoeken konden we ook magneetconfiguraties bepalen die de hoeveelheid deeltjes die na afzetting in de luchtpijp achterblijven maximaliseren.In een tweede reeks onderzoeken probeerden we deze optimale configuratie te gebruiken om het transductiepatroon aan te tonen dat voortkomt uit de in vivo afgifte van LV-MPs aan de luchtwegen van de rat, in de veronderstelling dat de afgifte van LV-MPs in de context van het richten op de luchtwegen zou resulteren in in verhoogde LV-transductie-efficiëntie..
Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de Universiteit van Adelaide (M-2019-060 en M-2020-022) en de SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van ARRIVE.
Alle röntgenfoto's zijn gemaakt op de BL20XU-bundellijn bij de SPring-8 synchrotron in Japan met behulp van een opstelling die vergelijkbaar is met die eerder beschreven .In het kort gezegd bevond de experimentele box zich op 245 m van de synchrotron-opslagring.Een monster-tot-detector-afstand van 0,6 m wordt gebruikt voor deeltjesbeeldvormingsstudies en 0,3 m voor in vivo beeldvormingsstudies om fasecontrasteffecten te creëren.Er werd een monochromatische straal met een energie van 25 keV gebruikt.De beelden werden verkregen met behulp van een röntgentransducer met hoge resolutie (SPring-8 BM3) gekoppeld aan een sCMOS-detector.De transducer zet röntgenstralen om in zichtbaar licht met behulp van een 10 µm dikke scintillator (Gd3Al2Ga3O12), die vervolgens naar de sCMOS-sensor wordt gericht met behulp van een x10 (NA 0,3) microscoopobjectief.De sCMOS-detector was een Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) met een arraygrootte van 2048 x 2048 pixels en een ruwe pixelgrootte van 6,5 x 6,5 µm.Deze instelling geeft een effectieve isotrope pixelgrootte van 0,51 µm en een gezichtsveld van ongeveer 1,1 mm x 1,1 mm.De blootstellingsduur van 100 ms werd gekozen om de signaal-ruisverhouding van magnetische deeltjes binnen en buiten de luchtwegen te maximaliseren en tegelijkertijd bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling te minimaliseren.Voor in vivo onderzoeken werd een snelle röntgensluiter in het röntgenpad geplaatst om de stralingsdosis te beperken door de röntgenbundel tussen belichtingen te blokkeren.
LV-media werden in geen enkel SPring-8 PB-PCXI-beeldvormingsonderzoek gebruikt omdat de BL20XU-beeldvormingskamer niet gecertificeerd is op bioveiligheidsniveau 2.In plaats daarvan hebben we een reeks goed gekarakteriseerde MP's geselecteerd van twee commerciële leveranciers die een reeks afmetingen, materialen, ijzerconcentraties en toepassingen bestrijken. Eerst om te begrijpen hoe magnetische velden de beweging van MP's in glazen capillairen beïnvloeden, en vervolgens om levende luchtwegen.oppervlak.De grootte van de MP varieert van 0,25 tot 18 µm en is gemaakt van verschillende materialen (zie Tabel 1), maar de samenstelling van elk monster, inclusief de grootte van de magnetische deeltjes in de MP, is onbekend.Op basis van onze uitgebreide MCT-onderzoeken 19, 20, 21, 23, 24 verwachten we dat MP's tot 5 µm zichtbaar zijn op het tracheale luchtwegoppervlak, bijvoorbeeld door opeenvolgende frames af te trekken om een ​​betere zichtbaarheid van MP-beweging te zien.Een enkele MP van 0,25 µm is kleiner dan de resolutie van het beeldapparaat, maar van PB-PCXI wordt verwacht dat hij het volumetrische contrast en de beweging van de oppervlaktevloeistof waarop ze worden afgezet nadat ze zijn afgezet, detecteert.
Voorbeelden voor elke MP in de tabel.1 werd bereid in glazen capillairen van 20 μl (Drummond Microcaps, PA, VS) met een interne diameter van 0,63 mm.Corpusculaire deeltjes zijn verkrijgbaar in water, terwijl CombiMag-deeltjes verkrijgbaar zijn in de door de fabrikant ontwikkelde vloeistof.Elk buisje wordt voor de helft gevuld met vloeistof (ongeveer 11 µl) en op de monsterhouder geplaatst (zie figuur 1).De glazen capillairen werden respectievelijk horizontaal op het podium in de beeldkamer geplaatst en aan de randen van de vloeistof geplaatst.Een nikkel-schaalmagneet met een diameter van 19 mm (28 mm lang), gemaakt van zeldzame aarde, neodymium, ijzer en boor (NdFeB) (N35, cat.nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australië) met een remanentie van 1,17 T werd bevestigd aan een aparte transfertafel om op afstand uw positie te veranderen tijdens het renderen.Röntgenbeeldvorming begint wanneer de magneet ongeveer 30 mm boven het monster wordt geplaatst en beelden worden verkregen met 4 frames per seconde.Tijdens de beeldvorming werd de magneet dicht bij de glazen capillaire buis gebracht (op een afstand van ongeveer 1 mm) en vervolgens langs de buis bewogen om het effect van de veldsterkte en de positie te beoordelen.
Een in vitro beeldopstelling met MP-monsters in glazen capillairen in het stadium van translatie van het xy-monster.Het pad van de röntgenbundel is gemarkeerd met een rode stippellijn.
Nadat de in vitro zichtbaarheid van MP's was vastgesteld, werd een subset ervan in vivo getest op wildtype vrouwelijke Wistar-albinoratten (~ 12 weken oud, ~ 200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) en butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Ratten werden verdoofd met een Pharma (Japan)-mengsel door middel van intraperitoneale injectie.Na anesthesie werden ze voorbereid op beeldvorming door de vacht rond de luchtpijp te verwijderen, een endotracheale buis (ET; 16 Ga intraveneuze canule, Terumo BCT) in te brengen en ze in rugligging te immobiliseren op een op maat gemaakte beeldplaat met daarin een thermische zak. om de lichaamstemperatuur op peil te houden.22. De beeldverwerkingsplaat werd vervolgens onder een kleine hoek aan het monsterplatform in de beeldopnamebox bevestigd om de luchtpijp horizontaal op het röntgenbeeld uit te lijnen, zoals weergegeven in figuur 2a.
(a) In vivo beeldopstelling in de SPring-8 beeldeenheid, röntgenbundelpad gemarkeerd met rode stippellijn.( b, c ) Lokalisatie van de tracheale magneet werd op afstand uitgevoerd met behulp van twee orthogonaal gemonteerde IP-camera's.Aan de linkerkant van de afbeelding op het scherm ziet u de draadlus die de kop vasthoudt, en de plaatsingscanule die in de ET-buis is geïnstalleerd.
Een op afstand bestuurd spuitpompsysteem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) met behulp van een glazen injectiespuit van 100 µl werd verbonden met een PE10-buis (0,61 mm buitendiameter, 0,28 mm binnendiameter) met behulp van een 30 Ga-naald.Markeer de tube om er zeker van te zijn dat de tip zich in de juiste positie in de luchtpijp bevindt bij het inbrengen van de endotracheale tube.Met behulp van een micropomp werd de plunjer van de injectiespuit verwijderd en werd de punt van de buis ondergedompeld in het af te leveren MP-monster.De geladen plaatsingsbuis werd vervolgens in de endotracheale buis ingebracht, waarbij de punt op het sterkste deel van het verwachte aangelegde magnetische veld werd geplaatst.De beeldacquisitie werd gecontroleerd met behulp van een ademdetector die was aangesloten op onze Arduino-gebaseerde timingbox, en alle signalen (bijvoorbeeld temperatuur, ademhaling, sluiter open/dicht en beeldacquisitie) werden opgenomen met behulp van Powerlab en LabChart (AD Instruments, Sydney, Australië) 22 Bij beeldvorming Toen de behuizing niet beschikbaar was, werden twee IP-camera's (Panasonic BB-SC382) op ongeveer 90° ten opzichte van elkaar geplaatst en gebruikt om de positie van de magneet ten opzichte van de luchtpijp tijdens beeldvorming te controleren (Figuur 2b, c).Om bewegingsartefacten te minimaliseren, werd één beeld per ademhaling verkregen tijdens het terminale ademhalingsstroomplateau.
De magneet is bevestigd aan de tweede trap, die zich op afstand aan de buitenkant van het beeldlichaam kan bevinden.Verschillende posities en configuraties van de magneet werden getest, waaronder: geplaatst in een hoek van ongeveer 30° boven de luchtpijp (configuraties worden getoond in figuren 2a en 3a);één magneet boven het dier en de andere eronder, met de polen ingesteld voor aantrekking (Figuur 3b)., één magneet boven het dier en één eronder, met de polen ingesteld op afstoting (figuur 3c), en één magneet boven en loodrecht op de luchtpijp (figuur 3d).Na het opzetten van het dier en de magneet en het laden van de te testen MP in de spuitpomp, dient u bij het maken van de beelden een dosis van 50 µl toe met een snelheid van 4 µl/sec.De magneet wordt vervolgens langs of over de luchtpijp heen en weer bewogen terwijl hij beelden blijft opnemen.
Magneetconfiguratie voor in vivo beeldvorming (a) één magneet boven de luchtpijp in een hoek van ongeveer 30°, (b) twee magneten geconfigureerd voor aantrekking, (c) twee magneten geconfigureerd voor afstoting, (d) één magneet boven en loodrecht op de luchtpijp.De waarnemer keek vanuit de mond naar de longen door de luchtpijp en de röntgenstraal ging door de linkerkant van de rat en verliet de rechterkant.De magneet wordt langs de lengte van de luchtwegen bewogen of naar links en rechts boven de luchtpijp in de richting van de röntgenbundel.
We hebben ook geprobeerd de zichtbaarheid en het gedrag van deeltjes in de luchtwegen te bepalen bij afwezigheid van vermenging van ademhaling en hartslag.Daarom werden dieren aan het einde van de beeldvormingsperiode op humane wijze geëuthanaseerd vanwege een overdosis pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, VS; ~65 mg/kg ip).Sommige dieren werden op het beeldvormingsplatform achtergelaten en na het stoppen van de ademhaling en de hartslag werd het beeldvormingsproces herhaald, waarbij een extra dosis MP werd toegevoegd als er geen MP zichtbaar was op het luchtwegoppervlak.
De resulterende beelden werden gecorrigeerd voor vlak en donker veld en vervolgens samengevoegd tot een film (20 frames per seconde; 15-25 x normale snelheid, afhankelijk van de ademhalingsfrequentie) met behulp van een aangepast script geschreven in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle onderzoeken naar de afgifte van LV-genvectoren werden uitgevoerd aan het Laboratory Animal Research Centre van de Universiteit van Adelaide en hadden tot doel de resultaten van het SPring-8-experiment te gebruiken om te beoordelen of de afgifte van LV-MP in de aanwezigheid van een magnetisch veld de genoverdracht in vivo zou kunnen verbeteren. .Om de effecten van MF en het magnetische veld te evalueren, werden twee groepen dieren behandeld: de ene groep werd geïnjecteerd met LV MF met magneetplaatsing, en de andere groep werd geïnjecteerd met een controlegroep met LV MF zonder magneet.
LV-genvectoren zijn gegenereerd met behulp van eerder beschreven methoden 25, 26.De LacZ-vector brengt een nucleair gelokaliseerd bèta-galactosidasegen tot expressie, aangedreven door de constitutieve promotor van MPSV (LV-LacZ), die een blauw reactieproduct produceert in getransduceerde cellen, zichtbaar op fronten en secties van longweefsel.Titratie werd uitgevoerd in celculturen door het aantal LacZ-positieve cellen handmatig te tellen met behulp van een hemocytometer om de titer in TU/ml te berekenen.Dragers worden bij -80°C gecryopreserveerd, vóór gebruik ontdooid en aan CombiMag gebonden door 1:1 te mengen en gedurende ten minste 30 minuten vóór aflevering op ijs te incuberen.
Normale Sprague Dawley-ratten (n = 3/groep, ~2-3 verdoofd ip met een mengsel van 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australië) en 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australië) op de leeftijd van 1 maand) ip ) injectie en niet-chirurgische orale canulatie met een intraveneuze canule van 16 Ga.Om ervoor te zorgen dat tracheaal luchtwegweefsel LV-transductie ontvangt, werd het geconditioneerd met behulp van ons eerder beschreven mechanische verstoringsprotocol waarbij het tracheale luchtwegoppervlak axiaal werd gewreven met een draadmand (N-Circle, nitinolsteenextractor zonder tip NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, VS) 30 p28.Vervolgens werd ongeveer 10 minuten na de verstoring in het bioveiligheidskabinet tracheale toediening van LV-MP uitgevoerd.
Het magnetische veld dat in dit experiment werd gebruikt, was op dezelfde manier geconfigureerd als bij een in vivo röntgenonderzoek, waarbij dezelfde magneten boven de luchtpijp werden gehouden met destillatiestentklemmen (Figuur 4).Een volume van 50 µl (2 x 25 µl aliquots) LV-MP werd afgeleverd in de luchtpijp (n = 3 dieren) met behulp van een pipet met gelpunt, zoals eerder beschreven.De controlegroep (n = 3 dieren) ontving dezelfde LV-MP zonder gebruik van een magneet.Na voltooiing van de infusie wordt de canule uit de endotracheale tube verwijderd en wordt het dier geëxtubeerd.De magneet blijft 10 minuten op zijn plaats voordat hij wordt verwijderd.Ratten kregen subcutaan een dosis meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australië) gevolgd door onttrekking van de anesthesie door intraperitoneale injectie van 1 mg/kg atipamazolhydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australië).Ratten werden warm gehouden en geobserveerd tot volledig herstel uit de anesthesie.
LV-MP afleverapparaat in een biologische veiligheidskast.U kunt zien dat de lichtgrijze Luer-lockhuls van de ET-buis uit de mond steekt en dat de gelpipetpunt, weergegeven in de afbeelding, door de ET-buis tot de gewenste diepte in de luchtpijp wordt ingebracht.
Eén week na de LV-MP-toedieningsprocedure werden de dieren op humane wijze opgeofferd door inhalatie van 100% CO2 en werd de LacZ-expressie beoordeeld met behulp van onze standaard X-gal-behandeling.De drie meest caudale kraakbeenringen werden verwijderd om ervoor te zorgen dat eventuele mechanische schade of vochtretentie als gevolg van plaatsing van een endotracheale tube niet in de analyse zou worden opgenomen.Elke luchtpijp werd in de lengte doorgesneden om twee helften te verkrijgen voor analyse en in een beker met siliconenrubber (Sylgard, Dow Inc) geplaatst met behulp van een Minutien-naald (Fine Science Tools) om het luminale oppervlak zichtbaar te maken.De verdeling en het karakter van de getransduceerde cellen werden bevestigd door frontale fotografie met behulp van een Nikon-microscoop (SMZ1500) met een DigiLite-camera en TCapture-software (Tucsen Photonics, China).Beelden werden verkregen met een vergroting van 20x (inclusief de maximale instelling voor de volledige breedte van de luchtpijp), waarbij de gehele lengte van de luchtpijp stap voor stap werd weergegeven, waardoor er voldoende overlap tussen elk beeld ontstond om beelden te kunnen ‘samenvoegen’.De beelden van elke luchtpijp werden vervolgens gecombineerd tot een enkel samengesteld beeld met behulp van Composite Image Editor versie 2.0.3 (Microsoft Research) met behulp van het planaire bewegingsalgoritme. Het gebied van LacZ-expressie in de tracheale samengestelde beelden van elk dier werd gekwantificeerd met behulp van een geautomatiseerd MATLAB-script (R2020a, MathWorks) zoals eerder beschreven , met behulp van instellingen van 0,35 < Tint <0,58, Verzadiging> 0,15 en Waarde <0,7. Het gebied van LacZ-expressie in de tracheale samengestelde beelden van elk dier werd gekwantificeerd met behulp van een geautomatiseerd MATLAB-script (R2020a, MathWorks) zoals eerder beschreven, met behulp van instellingen van 0,35 < Tint <0,58, Verzadiging> 0,15 en Waarde <0,7. Площадь экспресug ... оматизированног сценария Matlab (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с исполззззем настроек 0,35's значение <0 ,7. Het gebied van LacZ-expressie in samengestelde tracheale beelden van elk dier werd gekwantificeerd met behulp van een geautomatiseerd MATLAB-script (R2020a, MathWorks) zoals eerder beschreven met instellingen van 0,350,15 en waarde<0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0.35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的0,35 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 .................... HEUP Meer informatie over LacZ op het gebied van de kredietverlening met een programma voor MATLAB (R2020a, MathWorks), met een optie 0, 35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 en значение <0,7 . Gebieden van LacZ-expressie op samengestelde beelden van de luchtpijp van elk dier werden gekwantificeerd met behulp van een geautomatiseerd MATLAB-script (R2020a, MathWorks) zoals eerder beschreven met behulp van instellingen van 0,35 < tint <0,58, verzadiging> 0,15 en waarde <0,7.Door de weefselcontouren in GIMP v2.10.24 te volgen, werd voor elk samengesteld beeld handmatig een masker gemaakt om het weefselgebied te identificeren en valse detecties buiten het tracheale weefsel te voorkomen.De bevlekte gebieden van alle samengestelde beelden van elk dier werden opgeteld om het totale bevlekte gebied voor dat dier te verkrijgen.Het geverfde gebied werd vervolgens gedeeld door de totale oppervlakte van het masker om een ​​genormaliseerd gebied te verkrijgen.
Elke luchtpijp werd ingebed in paraffine en in plakjes gesneden van 5 µm dik.Secties werden gedurende 5 minuten tegengekleurd met neutraal snel rood en beelden werden verkregen met behulp van een Nikon Eclipse E400-microscoop, DS-Fi3-camera en NIS-elementopnamesoftware (versie 5.20.00).
Alle statistische analyses werden uitgevoerd in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).De statistische significantie werd vastgesteld op p ≤ 0,05.De normaliteit werd getest met behulp van de Shapiro-Wilk-test en verschillen in LacZ-kleuring werden beoordeeld met behulp van een ongepaarde t-test.
De zes MP's beschreven in Tabel 1 werden onderzocht door PCXI en de zichtbaarheid wordt beschreven in Tabel 2. Twee MP's van polystyreen (respectievelijk MP1 en MP2; 18 µm en 0,25 µm) waren niet zichtbaar door PCXI, maar de overige monsters konden worden geïdentificeerd. (voorbeelden worden getoond in Figuur 5).MP3 en MP4 zijn zwak zichtbaar (respectievelijk 10-15% Fe3O4; 0,25 µm en 0,9 µm).Hoewel MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) enkele van de kleinste geteste deeltjes bevatte, was dit het meest uitgesproken.Het CombiMag MP6-product is moeilijk te onderscheiden.In alle gevallen werd ons vermogen om MF’s te detecteren aanzienlijk verbeterd door de magneet parallel aan het capillair heen en weer te bewegen.Terwijl de magneten zich van het capillair verwijderden, werden de deeltjes in lange ketens naar buiten getrokken, maar naarmate de magneten naderden en de magnetische veldsterkte toenam, werden de deeltjesketens korter naarmate de deeltjes naar het bovenoppervlak van het capillair migreerden (zie aanvullende video S1 : MP4), waardoor de deeltjesdichtheid aan het oppervlak toeneemt.Omgekeerd, wanneer de magneet uit het capillair wordt verwijderd, neemt de veldsterkte af en herschikken de MP's zich in lange ketens die zich uitstrekken vanaf het bovenoppervlak van het capillair (zie aanvullende video S2: MP4).Nadat de magneet stopt met bewegen, blijven de deeltjes nog enige tijd bewegen nadat ze de evenwichtspositie hebben bereikt.Terwijl de MP naar en van het bovenoppervlak van het capillair beweegt, hebben de magnetische deeltjes de neiging vuil door de vloeistof te trekken.
De zichtbaarheid van MP onder PCXI varieert aanzienlijk tussen monsters.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6.Alle hier getoonde afbeeldingen zijn gemaakt met een magneet die ongeveer 10 mm direct boven het capillair is geplaatst.De ogenschijnlijk grote cirkels zijn luchtbellen die gevangen zitten in de haarvaten, waardoor duidelijk de zwart-witte randkenmerken van het fasecontrastbeeld zichtbaar zijn.Het rode vakje geeft de vergroting aan die het contrast vergroot.Merk op dat de diameters van de magneetcircuits in alle figuren niet op schaal zijn en ongeveer 100 keer groter zijn dan weergegeven.
Terwijl de magneet langs de bovenkant van het capillair naar links en rechts beweegt, verandert de hoek van de MP-reeks zodat deze op één lijn komt met de magneet (zie figuur 6), waardoor de magnetische veldlijnen worden afgebakend.Bij MP3-5 slepen de deeltjes langs het bovenoppervlak van het capillair nadat het akkoord de drempelhoek heeft bereikt.Dit resulteert vaak in het clusteren van parlementsleden in grotere groepen in de buurt van de plaats waar het magnetische veld het sterkst is (zie aanvullende video S3: MP5).Dit is ook vooral duidelijk bij beeldvorming dicht bij het uiteinde van het capillair, waardoor de MP aggregeert en zich concentreert op het grensvlak tussen vloeistof en lucht.De deeltjes in de MP6, die moeilijker te onderscheiden waren dan die in de MP3-5, sleepten niet mee toen de magneet langs het capillair bewoog, maar de MP-snaren dissocieerden, waardoor de deeltjes zichtbaar bleven (zie aanvullende video S4: MP6).In sommige gevallen, wanneer het aangelegde magnetische veld werd verminderd door de magneet over een lange afstand van de beeldlocatie te verplaatsen, daalden de resterende MP's door de zwaartekracht langzaam naar het bodemoppervlak van de buis en bleven in de string (zie aanvullende video S5: MP3) .
De hoek van de MP-string verandert naarmate de magneet naar rechts boven het capillair beweegt.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6.Het rode vakje geeft de vergroting aan die het contrast vergroot.Houd er rekening mee dat de aanvullende video's voor informatieve doeleinden zijn, omdat ze belangrijke deeltjesstructuur en dynamische informatie onthullen die niet in deze statische afbeeldingen kan worden gevisualiseerd.
Onze tests hebben aangetoond dat het langzaam heen en weer bewegen van de magneet langs de luchtpijp de visualisatie van de MF in de context van complexe bewegingen in vivo vergemakkelijkt.Er zijn geen in vivo tests uitgevoerd omdat de polystyreenbolletjes (MP1 en MP2) niet zichtbaar waren in het capillair.Elk van de overige vier MF's werd in vivo getest met de lange as van de magneet boven de luchtpijp geplaatst onder een hoek van ongeveer 30 ° met de verticaal (zie figuren 2b en 3a), omdat dit resulteerde in langere MF-ketens en effectiever was. dan een magneet..configuratie beëindigd.MP3, MP4 en MP6 zijn niet aangetroffen in de luchtpijp van levende dieren.Bij het visualiseren van de luchtwegen van ratten nadat de dieren op humane wijze waren gedood, bleven de deeltjes onzichtbaar, zelfs als er extra volume werd toegevoegd met behulp van een spuitpomp.MP5 had het hoogste ijzeroxidegehalte en was het enige zichtbare deeltje, dus werd het gebruikt om MP-gedrag in vivo te evalueren en karakteriseren.
Plaatsing van de magneet over de luchtpijp tijdens het inbrengen van MF had tot gevolg dat veel, maar niet alle, MF's zich in het gezichtsveld concentreerden.Het binnendringen van deeltjes in de luchtpijp wordt het best waargenomen bij op humane wijze geëuthanaseerde dieren.Figuur 7 en aanvullende video S6: MP5 toont snelle magnetische opname en uitlijning van deeltjes op het oppervlak van de ventrale luchtpijp, wat aangeeft dat MP's op de gewenste gebieden van de luchtpijp kunnen worden gericht.Bij het meer distaal zoeken langs de luchtpijp na MF-afgifte werden sommige MF's dichter bij de carina gevonden, wat erop wijst dat er onvoldoende magnetische veldsterkte is om alle MF's te verzamelen en vast te houden, aangezien ze tijdens vloeistoftoediening door het gebied met maximale magnetische veldsterkte werden afgegeven.proces.De postnatale MP-concentraties waren echter hoger rond het beeldgebied, wat erop wijst dat veel MP's in de luchtwegen bleven waar de toegepaste magnetische veldsterkte het hoogst was.
Afbeeldingen van (a) vóór en (b) na toediening van MP5 in de luchtpijp van een onlangs geëuthanaseerde rat met een magneet die net boven het beeldgebied is geplaatst.Het afgebeelde gebied bevindt zich tussen twee kraakbeenringen.Er zit wat vocht in de luchtwegen voordat de MP wordt toegediend.Het rode vakje geeft de vergroting aan die het contrast vergroot.Deze afbeeldingen zijn afkomstig uit de video in S6: MP5 aanvullende video.
Het in vivo verplaatsen van de magneet langs de luchtpijp resulteerde in een verandering in de hoek van de MP-keten op het luchtwegoppervlak, vergelijkbaar met die waargenomen in haarvaten (zie figuur 8 en aanvullende video S7: MP5).In onze studie konden parlementsleden echter niet over het oppervlak van levende luchtwegen worden gesleept, zoals haarvaten dat wel zouden kunnen doen.In sommige gevallen wordt de MP-ketting langer naarmate de magneet naar links en rechts beweegt.Interessant is dat we ook ontdekten dat de deeltjesketen de diepte van de oppervlaktelaag van de vloeistof verandert wanneer de magneet longitudinaal langs de luchtpijp wordt bewogen, en uitzet wanneer de magneet direct boven het hoofd wordt bewogen en de deeltjesketen naar een verticale positie wordt gedraaid (zie Aanvullende video S7).: MP5 op 0:09, rechtsonder).Het karakteristieke bewegingspatroon veranderde toen de magneet lateraal over de bovenkant van de luchtpijp werd bewogen (dwz links of rechts van het dier, in plaats van langs de lengte van de luchtpijp).De deeltjes waren nog steeds duidelijk zichtbaar tijdens hun beweging, maar toen de magneet uit de luchtpijp werd verwijderd, werden de uiteinden van de deeltjesstrengen zichtbaar (zie aanvullende video S8: MP5, beginnend bij 0:08).Dit komt overeen met het waargenomen gedrag van het magnetische veld onder invloed van een aangelegd magnetisch veld in een glazen capillair.
Voorbeeldafbeeldingen van MP5 in de luchtpijp van een levend verdoofde rat.(a) De magneet wordt gebruikt om beelden boven en links van de luchtpijp te verkrijgen, en vervolgens (b) nadat de magneet naar rechts is verplaatst.Het rode vakje geeft de vergroting aan die het contrast vergroot.Deze afbeeldingen komen uit de video in de aanvullende video van S7: MP5.
Wanneer de twee polen in een noord-zuid-oriëntatie boven en onder de luchtpijp waren afgestemd (dwz aantrekkend; figuur 3b), leken de MP-akkoorden langer en bevonden ze zich op de laterale wand van de luchtpijp in plaats van op het dorsale oppervlak van de luchtpijp. luchtpijp (zie bijlage).Video S9:MP5).Hoge concentraties deeltjes op één plaats (dat wil zeggen het dorsale oppervlak van de luchtpijp) werden echter niet gedetecteerd na vloeistoftoediening met behulp van een apparaat met dubbele magneet, wat gewoonlijk voorkomt bij een apparaat met enkele magneet.Toen één magneet vervolgens werd geconfigureerd om tegengestelde polen af ​​te stoten (Figuur 3c), nam het aantal zichtbare deeltjes in het gezichtsveld na levering niet toe.Het opzetten van beide magneetconfiguraties is een uitdaging vanwege de hoge magnetische veldsterkte die de magneten respectievelijk aantrekt of duwt.De opstelling werd vervolgens gewijzigd in een enkele magneet evenwijdig aan de luchtwegen, maar die onder een hoek van 90 graden door de luchtwegen ging, zodat de krachtlijnen orthogonaal de tracheale wand kruisten (figuur 3d), een oriëntatie bedoeld om de mogelijkheid van deeltjesaggregatie op de luchtwegen te bepalen. de zijwand.Worden waargenomen.In deze configuratie was er echter geen identificeerbare MF-accumulatiebeweging of magneetbeweging.Op basis van al deze resultaten werd een configuratie met een enkele magneet en een oriëntatie van 30 graden gekozen voor in vivo studies van gendragers (Fig. 3a).
Toen het dier onmiddellijk nadat het op humane wijze was geofferd, meerdere keren in beeld werd gebracht, betekende de afwezigheid van interfererende weefselbeweging dat fijnere, kortere deeltjeslijnen konden worden onderscheiden in het heldere interkraakbeenachtige veld, 'zwaaiend' in overeenstemming met de translatiebeweging van de magneet.zie duidelijk de aanwezigheid en beweging van MP6-deeltjes.
De titer van LV-LacZ was 1,8 x 108 IE/ml, en na 1:1 mengen met CombiMag MP (MP6) werden de dieren geïnjecteerd met 50 µl van een tracheale dosis van 9 x 107 IE/ml LV-vehiculum (dat wil zeggen 4,5 x 106 TU/rat).).).In deze onderzoeken hebben we, in plaats van de magneet tijdens de bevalling te bewegen, de magneet in één positie gefixeerd om te bepalen of de LV-transductie (a) verbeterd kon worden vergeleken met vectorafgifte bij afwezigheid van een magnetisch veld, en (b) of de luchtweg zou kunnen worden verbeterd. wees geconcentreerd.De cellen worden getransduceerd in de magnetische doelgebieden van de bovenste luchtwegen.
De aanwezigheid van magneten en het gebruik van CombiMag in combinatie met LV-vectoren leken geen nadelige invloed te hebben op de diergezondheid, net als ons standaard LV-vectortoedieningsprotocol.Frontale beelden van het tracheale gebied onderworpen aan mechanische verstoring (aanvullende figuur 1) toonden aan dat de met LV-MP behandelde groep significant hogere transductieniveaus had in de aanwezigheid van een magneet (figuur 9a).Er was slechts een kleine hoeveelheid blauwe LacZ-kleuring aanwezig in de controlegroep (Figuur 9b).Kwantificering van met X-Gal gekleurde genormaliseerde gebieden toonde aan dat toediening van LV-MP in de aanwezigheid van een magnetisch veld resulteerde in een ongeveer zesvoudige verbetering (Fig. 9c).
Voorbeeld van samengestelde beelden die tracheale transductie met LV-MP tonen (a) in aanwezigheid van een magnetisch veld en (b) in afwezigheid van een magneet.(c) Statistisch significante verbetering in het genormaliseerde gebied van LacZ-transductie in de luchtpijp met behulp van een magneet (*p = 0,029, t-test, n = 3 per groep, gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde).
Neutrale, snelle roodgekleurde secties (voorbeeld getoond in aanvullende figuur 2) gaven aan dat LacZ-gekleurde cellen aanwezig waren in hetzelfde monster en op dezelfde locatie als eerder gerapporteerd.
De belangrijkste uitdaging bij gentherapie voor de luchtwegen blijft de precieze lokalisatie van dragerdeeltjes in interessegebieden en het bereiken van een hoog niveau van transductie-efficiëntie in de mobiele long in aanwezigheid van luchtstroom en actieve slijmopruiming.Voor LV-dragers bedoeld voor de behandeling van luchtwegaandoeningen bij cystische fibrose is het vergroten van de verblijftijd van de dragerdeeltjes in de geleidende luchtwegen tot nu toe een onhaalbaar doel geweest.Zoals opgemerkt door Castellani et al. heeft het gebruik van magnetische velden om de transductie te verbeteren voordelen ten opzichte van andere methoden voor genafgifte, zoals elektroporatie, omdat het eenvoud, zuinigheid, gelokaliseerde afgifte, verhoogde efficiëntie en kortere incubatietijd kan combineren.en mogelijk een lagere dosis vehikel10.De in vivo afzetting en het gedrag van magnetische deeltjes in de luchtwegen onder invloed van externe magnetische krachten is echter nooit beschreven, en in feite is het vermogen van deze methode om de genexpressieniveaus in intacte levende luchtwegen te verhogen in vivo niet aangetoond.
Onze in vitro-experimenten met de PCXI-synchrotron lieten zien dat alle deeltjes die we testten, met uitzondering van het MP-polystyreen, zichtbaar waren in de beeldopstelling die we gebruikten.In de aanwezigheid van een magnetisch veld vormen magnetische velden snaren waarvan de lengte gerelateerd is aan het type deeltjes en de sterkte van het magnetische veld (dat wil zeggen de nabijheid en beweging van de magneet).Zoals weergegeven in figuur 10 worden de snaren die we waarnemen gevormd wanneer elk afzonderlijk deeltje gemagnetiseerd wordt en zijn eigen lokale magnetische veld induceert.Deze afzonderlijke velden zorgen ervoor dat andere soortgelijke deeltjes zich verzamelen en zich verbinden met groepssnaarbewegingen als gevolg van lokale krachten van de lokale aantrekkings- en afstotingskrachten van andere deeltjes.
Diagram dat (a, b) ketens van deeltjes toont die zich vormen in met vloeistof gevulde capillairen en (c, d) een met lucht gevulde luchtpijp.Merk op dat de haarvaten en luchtpijp niet op schaal zijn getekend.Paneel (a) bevat ook een beschrijving van de MF die Fe3O4-deeltjes bevat, gerangschikt in ketens.
Toen de magneet over het capillair bewoog, bereikte de hoek van de deeltjesreeks de kritische drempel voor MP3-5 met Fe3O4, waarna de deeltjesreeks niet langer op zijn oorspronkelijke positie bleef, maar langs het oppervlak bewoog naar een nieuwe positie.magneet.Dit effect treedt waarschijnlijk op omdat het oppervlak van het glazen capillair glad genoeg is om deze beweging mogelijk te maken.Interessant genoeg gedroeg MP6 (CombiMag) zich niet op deze manier, misschien omdat de deeltjes kleiner waren, een andere coating of oppervlaktelading hadden, of omdat de gepatenteerde dragervloeistof hun bewegingsvermogen beïnvloedde.Het contrast in het CombiMag-deeltjesbeeld is ook zwakker, wat erop wijst dat de vloeistof en de deeltjes dezelfde dichtheid kunnen hebben en daarom niet gemakkelijk naar elkaar toe kunnen bewegen.Deeltjes kunnen ook vastlopen als de magneet te snel beweegt, wat aangeeft dat de magnetische veldsterkte de wrijving tussen deeltjes in de vloeistof niet altijd kan overwinnen, wat erop wijst dat de magnetische veldsterkte en de afstand tussen de magneet en het doelgebied niet als een voorwaarde mogen gelden. verrassing.belangrijk.Deze resultaten geven ook aan dat, hoewel magneten veel microdeeltjes kunnen opvangen die door het doelgebied stromen, het onwaarschijnlijk is dat er op magneten kan worden vertrouwd om CombiMag-deeltjes langs het oppervlak van de luchtpijp te bewegen.Daarom concludeerden we dat in vivo LV MF-onderzoeken statische magnetische velden zouden moeten gebruiken om zich fysiek op specifieke gebieden van de luchtwegboom te richten.
Zodra de deeltjes in het lichaam zijn afgeleverd, zijn ze moeilijk te identificeren in de context van het complexe bewegende weefsel van het lichaam, maar hun detectievermogen is verbeterd door de magneet horizontaal over de luchtpijp te bewegen om de MP-snaren te ‘wiebelen’.Hoewel real-time beeldvorming mogelijk is, is het gemakkelijker om de beweging van deeltjes te onderscheiden nadat het dier op humane wijze is gedood.MP-concentraties waren op deze locatie doorgaans het hoogst wanneer de magneet boven het beeldgebied werd geplaatst, hoewel sommige deeltjes meestal verderop in de luchtpijp werden aangetroffen.In tegenstelling tot in vitro-onderzoek kunnen deeltjes niet door de luchtpijp worden gesleept door de beweging van een magneet.Deze bevinding komt overeen met de manier waarop het slijm dat het oppervlak van de luchtpijp bedekt doorgaans ingeademde deeltjes verwerkt, ze in het slijm opsluit en ze vervolgens via het mucociliaire klaringsmechanisme verwijdert.
We veronderstelden dat het gebruik van magneten boven en onder de luchtpijp voor aantrekking (figuur 3b) zou kunnen resulteren in een uniformer magnetisch veld, in plaats van een magnetisch veld dat op één punt sterk geconcentreerd is, wat mogelijk zou resulteren in een meer uniforme verdeling van deeltjes..Ons vooronderzoek heeft echter geen duidelijk bewijs gevonden om deze hypothese te ondersteunen.Op dezelfde manier resulteerde het instellen van een paar magneten op afstoten (Fig. 3c) niet in het bezinken van meer deeltjes in het beeldgebied.Deze twee bevindingen tonen aan dat de opstelling met dubbele magneet de lokale controle van het MP-richten niet significant verbetert, en dat de resulterende sterke magnetische krachten moeilijk af te stemmen zijn, waardoor deze aanpak minder praktisch wordt.Op dezelfde manier verhoogde het oriënteren van de magneet boven en over de luchtpijp (Figuur 3d) ook niet het aantal deeltjes dat achterbleef in het afgebeelde gebied.Sommige van deze alternatieve configuraties zijn mogelijk niet succesvol omdat ze resulteren in een vermindering van de magnetische veldsterkte in de afzettingszone.De configuratie met een enkele magneet bij 30 graden (Fig. 3a) wordt dus beschouwd als de eenvoudigste en meest efficiënte in vivo testmethode.
Uit het LV-MP-onderzoek bleek dat wanneer LV-vectoren werden gecombineerd met CombiMag en werden afgeleverd nadat ze fysiek waren verstoord in de aanwezigheid van een magnetisch veld, de transductieniveaus in de luchtpijp aanzienlijk toenamen vergeleken met controles.Op basis van synchrotronbeeldvormingsstudies en LacZ-resultaten leek het magnetische veld in staat te zijn de LV in de luchtpijp te houden en het aantal vectordeeltjes te verminderen dat onmiddellijk diep in de longen doordrong.Dergelijke verbeteringen in de targeting kunnen leiden tot een hogere efficiëntie, terwijl de geleverde titers, niet-gerichte transductie, ontstekings- en immuunbijwerkingen en de kosten van genoverdracht worden verminderd.Belangrijk is dat CombiMag volgens de fabrikant kan worden gebruikt in combinatie met andere methoden voor genoverdracht, waaronder andere virale vectoren (zoals AAV) en nucleïnezuren.