Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).In de tussentijd zullen we, om voortdurende ondersteuning te garanderen, de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Genvectoren voor de behandeling van pulmonale cystische fibrose moeten gericht zijn op de geleidende luchtwegen, aangezien perifere longtransductie geen therapeutisch effect heeft.De efficiëntie van virale transductie is direct gerelateerd aan de verblijftijd van de drager.Toedieningsvloeistoffen zoals gendragers diffunderen echter van nature in de longblaasjes tijdens inhalatie, en therapeutische deeltjes van welke vorm dan ook worden snel verwijderd door mucociliair transport.Verlenging van de verblijftijd van gendragers in de luchtwegen is belangrijk maar moeilijk te realiseren.Drager-geconjugeerde magnetische deeltjes die naar het oppervlak van de luchtwegen kunnen worden gericht, kunnen de regionale targeting verbeteren.Vanwege problemen met in vivo beeldvorming wordt het gedrag van dergelijke kleine magnetische deeltjes op het luchtwegoppervlak in de aanwezigheid van een aangelegd magnetisch veld slecht begrepen.Het doel van deze studie was om synchrotron-beeldvorming te gebruiken om in vivo de beweging van een reeks magnetische deeltjes in de luchtpijp van verdoofde ratten te visualiseren om de dynamiek en gedragspatronen van enkele en bulkdeeltjes in vivo te bestuderen.Vervolgens hebben we ook beoordeeld of de afgifte van lentivirale magnetische deeltjes in de aanwezigheid van een magnetisch veld de efficiëntie van transductie in de luchtpijp van de rat zou verhogen.Synchrotron X-ray imaging toont het gedrag van magnetische deeltjes in stationaire en bewegende magnetische velden in vitro en in vivo.Deeltjes kunnen met behulp van magneten niet gemakkelijk over het oppervlak van levende luchtwegen worden gesleept, maar tijdens het transport worden de afzettingen geconcentreerd in het gezichtsveld, waar het magnetische veld het sterkst is.De transductie-efficiëntie werd ook verzesvoudigd wanneer lentivirale magnetische deeltjes werden afgeleverd in de aanwezigheid van een magnetisch veld.Alles bij elkaar genomen suggereren deze resultaten dat lentivirale magnetische deeltjes en magnetische velden waardevolle benaderingen kunnen zijn om genvectortargeting en transductieniveaus in de geleidende luchtwegen in vivo te verbeteren.
Cystic fibrosis (CF) wordt veroorzaakt door variaties in een enkel gen, de CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Het CFTR-eiwit is een ionenkanaal dat aanwezig is in veel epitheelcellen door het hele lichaam, inclusief de luchtwegen, een belangrijke plaats in de pathogenese van cystische fibrose.Defecten in CFTR leiden tot abnormaal watertransport, uitdroging van het luchtwegoppervlak en verminderde diepte van de luchtwegoppervlakvloeistoflaag (ASL).Het schaadt ook het vermogen van het mucociliaire transportsysteem (MCT) om de luchtwegen vrij te maken van ingeademde deeltjes en ziekteverwekkers.Ons doel is om een ​​lentivirale (LV) gentherapie te ontwikkelen om de juiste kopie van het CFTR-gen te leveren en de ASL-, MCT- en longgezondheid te verbeteren, en om door te gaan met het ontwikkelen van nieuwe technologieën die deze parameters in vivo kunnen meten1.
LV-vectoren zijn een van de belangrijkste kandidaten voor cystic fibrosis-gentherapie, voornamelijk omdat ze het therapeutische gen permanent kunnen integreren in basale cellen van de luchtwegen (luchtwegstamcellen).Dit is belangrijk omdat ze de normale hydratatie en slijmopruiming kunnen herstellen door te differentiëren in functionele gen-gecorrigeerde luchtwegoppervlakcellen geassocieerd met cystische fibrose, wat resulteert in levenslange voordelen.LV-vectoren moeten tegen de geleidende luchtwegen worden gericht, omdat hier de betrokkenheid van de longen bij CF begint.Het dieper in de long brengen van de vector kan leiden tot alveolaire transductie, maar dit heeft geen therapeutisch effect bij cystische fibrose.Vloeistoffen zoals gendragers migreren echter op natuurlijke wijze naar de longblaasjes wanneer ze worden ingeademd na de bevalling3,4 en therapeutische deeltjes worden door MCT's snel in de mondholte uitgestoten.De efficiëntie van LV-transductie is direct gerelateerd aan de tijdsduur dat de vector dicht bij de doelcellen blijft om cellulaire opname mogelijk te maken - "verblijftijd" 5 die gemakkelijk kan worden verkort door typische regionale luchtstroom en gecoördineerde opname van slijm en MCT-deeltjes.Voor cystische fibrose is het vermogen om de LV-verblijftijd in de luchtwegen te verlengen belangrijk om hoge niveaus van transductie in dit gebied te bereiken, maar tot nu toe was dit een uitdaging.
Om deze hindernis te overwinnen, stellen we voor dat LV magnetische deeltjes (MP's) op twee complementaire manieren kunnen helpen.Ten eerste kunnen ze door een magneet naar het luchtwegoppervlak worden geleid om het richten te verbeteren en gendragerdeeltjes te helpen zich in het juiste deel van de luchtweg te bevinden;en ASL) verplaatsen zich naar de cellaag 6. MP's worden veel gebruikt als gerichte vehikels voor medicijnafgifte wanneer ze binden aan antilichamen, geneesmiddelen voor chemotherapie of andere kleine moleculen die zich hechten aan celmembranen of binden aan hun respectievelijke celoppervlakreceptoren en zich ophopen op tumorplaatsen in aanwezigheid van statische elektriciteit.Magnetische velden voor kankertherapie 7. Andere 'hyperthermische' methoden zijn gericht op het doden van tumorcellen door MP's te verwarmen wanneer ze worden blootgesteld aan oscillerende magnetische velden.Het principe van magnetische transfectie, waarbij een magnetisch veld wordt gebruikt als transfectiemiddel om de overdracht van DNA in cellen te verbeteren, wordt gewoonlijk in vitro gebruikt met behulp van een reeks niet-virale en virale genvectoren voor moeilijk te transduceren cellijnen ..De efficiëntie van LV-magnetotransfectie met de afgifte van LV MP in vitro in een cellijn van menselijk bronchiaal epitheel in de aanwezigheid van een statisch magnetisch veld werd vastgesteld, waardoor de efficiëntie van transductie 186 keer toenam in vergelijking met de LV-vector alleen.LV MT is ook toegepast op een in vitro model van cystische fibrose, waarbij magnetische transfectie de LV-transductie in lucht-vloeistof-interfaceculturen met een factor 20 verhoogde in de aanwezigheid van cystic fibrosis-sputum10.In vivo orgaanmagnetotransfectie heeft echter relatief weinig aandacht gekregen en is slechts in enkele dierstudies geëvalueerd11,12,13,14,15, vooral in de longen16,17.De mogelijkheden van magnetische transfectie bij longtherapie bij cystische fibrose zijn echter duidelijk.Tan et al.(2020) stelde dat "een validatiestudie naar effectieve afgifte van magnetische nanodeeltjes in de longen de weg zal effenen voor toekomstige CFTR-inhalatiestrategieën om de klinische resultaten bij patiënten met cystische fibrose te verbeteren"6.
Het gedrag van kleine magnetische deeltjes op het oppervlak van de luchtwegen in aanwezigheid van een aangelegd magnetisch veld is moeilijk te visualiseren en te bestuderen, en daarom worden ze slecht begrepen.In andere onderzoeken hebben we een Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) -methode ontwikkeld voor niet-invasieve beeldvorming en kwantificering van minieme in vivo veranderingen in ASL18-diepte en MCT19-gedrag,20 om direct de hydratatie van het gaskanaaloppervlak te meten en wordt gebruikt als een vroege indicator voor de effectiviteit van de behandeling.Bovendien gebruikt onze MCT-scoringsmethode deeltjes met een diameter van 10–35 µm die zijn samengesteld uit aluminiumoxide of glas met een hoge brekingsindex als MCT-markers die zichtbaar zijn met PB-PCXI21.Beide methoden zijn geschikt voor het afbeelden van een reeks deeltjestypes, waaronder MP's.
Vanwege de hoge ruimtelijke en temporele resolutie zijn onze op PB-PCXI gebaseerde ASL- en MCT-assays zeer geschikt om de dynamiek en gedragspatronen van enkele en bulkdeeltjes in vivo te bestuderen om ons te helpen MP-genafgiftemethoden te begrijpen en te optimaliseren.De benadering die we hier gebruiken, is gebaseerd op onze studies met behulp van de SPring-8 BL20B2-bundellijn, waarin we vloeiende beweging visualiseerden na toediening van een dosis van een dummy-vector in de neus- en longluchtwegen van muizen om onze heterogene genexpressiepatronen te helpen verklaren waargenomen in ons gen.dierstudies met een dragerdosis van 3,4.
Het doel van deze studie was om de PB-PCXI synchrotron te gebruiken om in vivo bewegingen van een reeks MP's in de luchtpijp van levende ratten te visualiseren.Deze PB-PCXI-beeldvormingsonderzoeken zijn ontworpen om de MP-serie, magnetische veldsterkte en locatie te testen om hun effect op MP-beweging te bepalen.We gingen ervan uit dat een extern magnetisch veld de geleverde MF zou helpen om naar het doelgebied te blijven of te gaan.Deze studies stelden ons ook in staat om magneetconfiguraties te bepalen die de hoeveelheid deeltjes die na afzetting in de luchtpijp achterblijven maximaliseren.In een tweede reeks onderzoeken wilden we deze optimale configuratie gebruiken om het transductiepatroon te demonstreren dat resulteert uit in vivo toediening van LV-MP's aan de luchtwegen van ratten, in de veronderstelling dat afgifte van LV-MP's in de context van luchtwegtargeting zou resulteren in verhoogde LV-transductie-efficiëntie..
Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de Universiteit van Adelaide (M-2019-060 en M-2020-022) en de SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van ARRIVE.
Alle röntgenfoto's zijn gemaakt op de BL20XU-bundellijn bij de SPring-8 synchrotron in Japan met behulp van een opstelling die vergelijkbaar is met die eerder beschreven .Kort gezegd bevond de experimentele box zich op 245 m van de synchrotron-opslagring.Een monster-tot-detector-afstand van 0,6 m wordt gebruikt voor deeltjesbeeldvormingsonderzoeken en 0,3 m voor in vivo beeldvormingsonderzoeken om fasecontrasteffecten te creëren.Er werd een monochromatische bundel met een energie van 25 keV gebruikt.De beelden werden verkregen met behulp van een röntgentransducer met hoge resolutie (SPring-8 BM3) gekoppeld aan een sCMOS-detector.De transducer zet röntgenstralen om in zichtbaar licht met behulp van een 10 µm dikke scintillator (Gd3Al2Ga3O12), die vervolgens naar de sCMOS-sensor wordt geleid met behulp van een ×10 (NA 0,3) microscoopobjectief.De sCMOS-detector was een Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) met een arraygrootte van 2048 × 2048 pixels en een onbewerkte pixelgrootte van 6,5 × 6,5 µm.Deze instelling geeft een effectieve isotrope pixelgrootte van 0,51 µm en een gezichtsveld van ongeveer 1,1 mm × 1,1 mm.De blootstellingsduur van 100 ms werd gekozen om de signaal-ruisverhouding van magnetische deeltjes binnen en buiten de luchtwegen te maximaliseren, terwijl bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling worden geminimaliseerd.Voor in vivo studies werd een snelle röntgensluiter in het röntgenpad geplaatst om de stralingsdosis te beperken door de röntgenstraal tussen opnames te blokkeren.
LV-media werden niet gebruikt in SPring-8 PB-PCXI-beeldvormingsonderzoeken omdat de BL20XU-beeldvormingskamer niet Biosafety Level 2-gecertificeerd is.In plaats daarvan hebben we een reeks goed gekarakteriseerde MP's geselecteerd van twee commerciële verkopers die een reeks maten, materialen, ijzerconcentraties en toepassingen bestrijken, - eerst om te begrijpen hoe magnetische velden de beweging van MP's in glazen capillairen beïnvloeden, en vervolgens in levende luchtwegen.oppervlak.De grootte van de MP varieert van 0,25 tot 18 µm en is gemaakt van verschillende materialen (zie tabel 1), maar de samenstelling van elk monster, inclusief de grootte van de magnetische deeltjes in de MP, is onbekend.Op basis van onze uitgebreide MCT-onderzoeken 19, 20, 21, 23, 24 verwachten we dat MP's tot 5 µm kunnen worden gezien op het tracheale luchtwegoppervlak, bijvoorbeeld door opeenvolgende frames af te trekken om een ​​betere zichtbaarheid van MP-bewegingen te zien.Een enkele MP van 0,25 µm is kleiner dan de resolutie van het beeldvormingsapparaat, maar van PB-PCXI wordt verwacht dat ze hun volumetrische contrast en de beweging van de oppervlaktevloeistof waarop ze zijn afgezet, detecteren nadat ze zijn afgezet.
Voorbeelden voor elke MP in de tabel.1 werd bereid in glazen capillairen van 20 μl (Drummond Microcaps, PA, VS) met een inwendige diameter van 0,63 mm.Corpusculaire deeltjes zijn verkrijgbaar in water, terwijl CombiMag-deeltjes verkrijgbaar zijn in de eigen vloeistof van de fabrikant.Elk buisje is voor de helft gevuld met vloeistof (ongeveer 11 µl) en op de monsterhouder geplaatst (zie figuur 1).De glazen capillairen werden respectievelijk horizontaal op het podium in de beeldkamer geplaatst en aan de randen van de vloeistof geplaatst.Een nikkel-omhulselmagneet met een diameter van 19 mm (28 mm lang) gemaakt van zeldzame aarde, neodymium, ijzer en boor (NdFeB) (N35, cat.nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australië) met een remanentie van 1,17 T werd bevestigd aan een aparte transfertafel te bereiken Wijzig op afstand uw positie tijdens het renderen.Röntgenbeeldvorming begint wanneer de magneet ongeveer 30 mm boven het monster wordt geplaatst en beelden worden verkregen met 4 frames per seconde.Tijdens de beeldvorming werd de magneet dicht bij de glazen capillaire buis gebracht (op een afstand van ongeveer 1 mm) en vervolgens langs de buis bewogen om het effect van veldsterkte en positie te beoordelen.
Een in vitro beeldvormingsopstelling met MP-monsters in glazen capillairen in het stadium van translatie van het xy-monster.Het pad van de röntgenstraal is gemarkeerd met een rode stippellijn.
Nadat de in vitro zichtbaarheid van MP's was vastgesteld, werd een subset ervan in vivo getest op wildtype vrouwelijke Wistar albinoratten (~ 12 weken oud, ~ 200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) en butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Ratten werden verdoofd met Pharma (Japan) mengsel door intraperitoneale injectie.Na anesthesie werden ze voorbereid op beeldvorming door de vacht rond de luchtpijp te verwijderen, een endotracheale tube (ET; 16 Ga intraveneuze canule, Terumo BCT) in te brengen en ze in rugligging te immobiliseren op een op maat gemaakte beeldverwerkingsplaat met een thermische zak om de lichaamstemperatuur op peil te houden.22. De beeldverwerkingsplaat werd vervolgens onder een kleine hoek op het monsterplatform in de beeldvormingsdoos bevestigd om de luchtpijp horizontaal op het röntgenbeeld uit te lijnen, zoals weergegeven in figuur 2a.
( a ) In vivo beeldvormingsopstelling in de SPring-8 beeldvormingseenheid, röntgenstraalpad gemarkeerd met rode stippellijn.( b, c ) Tracheale magneetlokalisatie werd op afstand uitgevoerd met behulp van twee orthogonaal gemonteerde IP-camera's.Aan de linkerkant van het beeld op het scherm ziet u de draadlus die de kop vasthoudt en de plaatsingscanule die in de ET-buis is geïnstalleerd.
Een op afstand bestuurbaar spuitpompsysteem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) met behulp van een 100 µl glazen injectiespuit werd verbonden met een PE10-buis (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) met behulp van een 30 Ga-naald.Markeer de tube om er zeker van te zijn dat de tip zich in de juiste positie in de trachea bevindt wanneer de endotracheale tube wordt ingebracht.Met behulp van een micropomp werd de zuiger van de injectiespuit verwijderd en werd de punt van de buis ondergedompeld in het af te leveren MP-monster.De geladen plaatsingsbuis werd vervolgens in de endotracheale buis ingebracht, waarbij de punt op het sterkste deel van ons verwachte aangelegde magnetische veld werd geplaatst.Beeldacquisitie werd gecontroleerd met behulp van een ademdetector die was aangesloten op onze Arduino-gebaseerde timingbox, en alle signalen (bijv. Temperatuur, ademhaling, sluiter openen/sluiten en beeldacquisitie) werden geregistreerd met behulp van Powerlab en LabChart (AD Instruments, Sydney, Australië) 22 Bij beeldvorming Toen de behuizing niet beschikbaar was, werden twee IP-camera's (Panasonic BB-SC382) in een hoek van ongeveer 90° ten opzichte van elkaar geplaatst en gebruikt om de positie van de magneet ten opzichte van de luchtpijp tijdens beeldvorming te regelen (Afbeelding 2b, c).Om bewegingsartefacten te minimaliseren, werd één beeld per ademhaling verkregen tijdens het terminale ademhalingsstroomplateau.
De magneet is bevestigd aan de tweede trap, die zich op afstand aan de buitenzijde van het afbeeldingslichaam kan bevinden.Verschillende posities en configuraties van de magneet werden getest, waaronder: geplaatst in een hoek van ongeveer 30° boven de luchtpijp (configuraties worden getoond in figuren 2a en 3a);een magneet boven het dier en de andere eronder, met de polen ingesteld voor aantrekking (Figuur 3b)., een magneet boven het dier en een eronder, met de polen ingesteld voor afstoting (figuur 3c), en een magneet boven en loodrecht op de luchtpijp (figuur 3d).Na het opzetten van het dier en de magneet en het laden van de te testen MP in de spuitpomp, dient u een dosis van 50 µl toe met een snelheid van 4 µl/sec bij het verkrijgen van beelden.De magneet wordt dan heen en weer bewogen langs of over de luchtpijp terwijl beelden worden opgenomen.
Magneetconfiguratie voor in vivo beeldvorming (a) één magneet boven de luchtpijp in een hoek van ongeveer 30°, (b) twee magneten die zijn geconfigureerd voor aantrekking, (c) twee magneten die zijn geconfigureerd voor afstoting, (d) één magneet boven en loodrecht op de luchtpijp.De waarnemer keek van de mond naar de longen door de luchtpijp en de röntgenstraal ging door de linkerkant van de rat en verliet de rechterkant.De magneet wordt over de lengte van de luchtweg bewogen of links en rechts boven de luchtpijp in de richting van de röntgenstraal.
We hebben ook geprobeerd de zichtbaarheid en het gedrag van deeltjes in de luchtwegen te bepalen bij afwezigheid van vermenging van ademhaling en hartslag.Daarom werden dieren aan het einde van de beeldvormingsperiode op humane wijze geëuthanaseerd vanwege een overdosis pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, VS; ~ 65 mg / kg ip).Sommige dieren bleven achter op het beeldvormingsplatform en nadat de ademhaling en hartslag waren gestopt, werd het beeldvormingsproces herhaald, waarbij een extra dosis MP werd toegevoegd als er geen MP zichtbaar was op het luchtwegoppervlak.
De resulterende beelden werden gecorrigeerd voor vlak en donker veld en vervolgens samengevoegd tot een film (20 frames per seconde; 15-25 × normale snelheid afhankelijk van de ademhalingsfrequentie) met behulp van een aangepast script geschreven in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle onderzoeken naar LV-genvectorafgifte werden uitgevoerd aan het University of Adelaide Laboratory Animal Research Centre en hadden tot doel de resultaten van het SPring-8-experiment te gebruiken om te beoordelen of LV-MP-afgifte in de aanwezigheid van een magnetisch veld de genoverdracht in vivo zou kunnen verbeteren .Om de effecten van MF en magnetisch veld te evalueren, werden twee groepen dieren behandeld: één groep werd geïnjecteerd met LV MF met magneetplaatsing en de andere groep werd geïnjecteerd met een controlegroep met LV MF zonder magneet.
LV-genvectoren zijn gegenereerd met behulp van eerder beschreven methoden 25, 26.De LacZ-vector brengt een nucleair gelokaliseerd bèta-galactosidasegen tot expressie dat wordt aangestuurd door de constitutieve promotor van MPSV (LV-LacZ), die een blauw reactieproduct produceert in getransduceerde cellen, zichtbaar op fronten en delen van longweefsel.Titratie werd uitgevoerd in celculturen door handmatig het aantal LacZ-positieve cellen te tellen met behulp van een hemocytometer om de titer in TU/ml te berekenen.Dragers worden gecryopreserveerd bij -80°C, ontdooid voor gebruik en gebonden aan CombiMag door 1:1 te mengen en minstens 30 minuten op ijs te incuberen voorafgaand aan de levering.
Normale Sprague Dawley-ratten (n = 3/groep, ~2-3 verdoofd ip met een mengsel van 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australië) en 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australië) op een leeftijd van 1 maand) ip ) injectie en niet-chirurgische orale canulatie met een 16 Ga intraveneuze canule.Om ervoor te zorgen dat tracheaal luchtwegweefsel LV-transductie ontvangt, werd het geconditioneerd met behulp van ons eerder beschreven mechanische perturbatieprotocol waarin het tracheale luchtwegoppervlak axiaal werd gewreven met een draadmand (N-Circle, nitinol-steenextractor zonder punt NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, VS) 30 p28.Vervolgens, ongeveer 10 minuten na de verstoring in het bioveiligheidskabinet, werd tracheale toediening van LV-MP uitgevoerd.
Het magnetische veld dat in dit experiment werd gebruikt, was op dezelfde manier geconfigureerd als een in vivo röntgenonderzoek, met dezelfde magneten die met destillatiestentklemmen boven de luchtpijp werden gehouden (figuur 4).Een volume van 50 µl (2 x 25 µl aliquots) LV-MP werd afgeleverd in de luchtpijp (n = 3 dieren) met behulp van een gel-tip pipet zoals eerder beschreven.De controlegroep (n = 3 dieren) kreeg dezelfde LV-MP zonder het gebruik van een magneet.Na voltooiing van de infusie wordt de canule uit de endotracheale tube verwijderd en wordt het dier geëxtubeerd.De magneet blijft 10 minuten op zijn plaats voordat hij wordt verwijderd.Ratten werden subcutaan gedoseerd met meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australië) gevolgd door stopzetting van de anesthesie door intraperitoneale injectie van 1 mg/kg atipamazolhydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australië).Ratten werden warm gehouden en geobserveerd totdat ze volledig hersteld waren van de anesthesie.
LV-MP-toedieningsapparaat in een biologische veiligheidskast.U kunt zien dat de lichtgrijze Luer-lock-huls van de ET-buis uit de mond steekt en dat de punt van de gelpipet, zoals weergegeven in de afbeelding, door de ET-buis wordt gestoken tot de gewenste diepte in de luchtpijp.
Een week na de LV-MP-toedieningsprocedure werden de dieren op humane wijze opgeofferd door inademing van 100% CO2 en werd de LacZ-expressie beoordeeld met behulp van onze standaard X-gal-behandeling.De drie meest caudale kraakbeenringen werden verwijderd om ervoor te zorgen dat eventuele mechanische schade of vochtretentie als gevolg van plaatsing van de endotracheale tube niet in de analyse zou worden opgenomen.Elke trachea werd in de lengte doorgesneden om twee helften voor analyse te verkrijgen en in een kom met siliconenrubber (Sylgard, Dow Inc) geplaatst met behulp van een Minutien-naald (Fine Science Tools) om het luminale oppervlak zichtbaar te maken.De verdeling en het karakter van de getransduceerde cellen werden bevestigd door frontale fotografie met behulp van een Nikon-microscoop (SMZ1500) met een DigiLite-camera en TCapture-software (Tucsen Photonics, China).Er werden beelden verkregen met een vergroting van 20x (inclusief de maximale instelling voor de volledige breedte van de luchtpijp), waarbij de volledige lengte van de luchtpijp stap voor stap werd weergegeven, zodat er voldoende overlapping was tussen elk beeld om beelden te kunnen "hechten".De beelden van elke luchtpijp werden vervolgens gecombineerd tot een enkel samengesteld beeld met behulp van Composite Image Editor versie 2.0.3 (Microsoft Research) met behulp van het planaire bewegingsalgoritme. Het gebied van LacZ-expressie binnen de tracheale composietbeelden van elk dier werd gekwantificeerd met behulp van een geautomatiseerd MATLAB-script (R2020a, MathWorks) zoals eerder beschreven28, met instellingen van 0,35 < Tint < 0,58, Verzadiging > 0,15 en Waarde < 0,7. Het gebied van LacZ-expressie binnen de tracheale composietbeelden van elk dier werd gekwantificeerd met behulp van een geautomatiseerd MATLAB-script (R2020a, MathWorks) zoals eerder beschreven28, met instellingen van 0,35 < Tint < 0,58, Verzadiging > 0,15 en Waarde < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Het gebied van LacZ-expressie in samengestelde tracheale beelden van elk dier werd gekwantificeerd met behulp van een geautomatiseerd MATLAB-script (R2020a, MathWorks) zoals eerder beschreven met instellingen van 0,350,15 en waarde<0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 自动 MATLAB 脚本 （（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（） 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 量化 使用 使用 使用 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的 。。。。。 。。。。。 。。。。。 .................... HEUP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Gebieden van LacZ-expressie op samengestelde beelden van de luchtpijp van elk dier werden gekwantificeerd met behulp van een geautomatiseerd MATLAB-script (R2020a, MathWorks) zoals eerder beschreven met instellingen van 0,35 < tint < 0,58, verzadiging > 0,15 en waarde < 0,7.Door weefselcontouren te volgen in GIMP v2.10.24, werd handmatig een masker gemaakt voor elk samengesteld beeld om het weefselgebied te identificeren en valse detecties buiten het tracheale weefsel te voorkomen.De bevlekte gebieden van alle samengestelde beelden van elk dier werden opgeteld om het totale bevlekte gebied voor dat dier te geven.Het geverfde gebied werd vervolgens gedeeld door het totale gebied van het masker om een ​​genormaliseerd gebied te verkrijgen.
Elke trachea werd ingebed in paraffine en doorgesneden met een dikte van 5 µm.Secties werden tegengekleurd met neutraal snel rood gedurende 5 minuten en beelden werden verkregen met behulp van een Nikon Eclipse E400-microscoop, DS-Fi3-camera en NIS-elementopnamesoftware (versie 5.20.00).
Alle statistische analyses werden uitgevoerd in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistische significantie werd vastgesteld op p ≤ 0,05.Normaliteit werd getest met behulp van de Shapiro-Wilk-test en verschillen in LacZ-kleuring werden beoordeeld met behulp van een ongepaarde t-test.
De zes MP's beschreven in tabel 1 werden onderzocht door PCXI en de zichtbaarheid wordt beschreven in tabel 2. Twee polystyreen MP's (respectievelijk MP1 en MP2; 18 µm en 0,25 µm) waren niet zichtbaar door PCXI, maar de overige monsters konden worden geïdentificeerd (voorbeelden worden getoond in figuur 5).MP3 en MP4 zijn zwak zichtbaar (10-15% Fe3O4; respectievelijk 0,25 µm en 0,9 µm).Hoewel MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) enkele van de kleinste geteste deeltjes bevatte, was het het meest uitgesproken.Het product CombiMag MP6 is moeilijk te onderscheiden.In alle gevallen werd ons vermogen om MF's te detecteren aanzienlijk verbeterd door de magneet evenwijdig aan het capillair heen en weer te bewegen.Terwijl de magneten zich van het capillair verwijderden, werden de deeltjes in lange kettingen naar buiten getrokken, maar naarmate de magneten naderden en de magnetische veldsterkte toenam, werden de deeltjesketens korter naarmate de deeltjes naar het bovenoppervlak van het capillair migreerden (zie aanvullende video S1 : MP4), waardoor de deeltjesdichtheid aan het oppervlak toeneemt.Omgekeerd, wanneer de magneet uit het capillair wordt verwijderd, neemt de veldsterkte af en herschikken de MP's zich in lange kettingen die zich uitstrekken vanaf het bovenoppervlak van het capillair (zie aanvullende video S2: MP4).Nadat de magneet stopt met bewegen, blijven de deeltjes nog enige tijd bewegen nadat ze de evenwichtspositie hebben bereikt.Terwijl de MP naar en van het bovenoppervlak van het capillair beweegt, hebben de magnetische deeltjes de neiging om vuil door de vloeistof te trekken.
De zichtbaarheid van MP onder PCXI varieert aanzienlijk tussen monsters.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6.Alle hier getoonde afbeeldingen zijn gemaakt met een magneet die ongeveer 10 mm direct boven het capillair is geplaatst.De ogenschijnlijk grote cirkels zijn luchtbellen die vastzitten in de haarvaten en die duidelijk de zwart-witte randkenmerken van het fasecontrastbeeld laten zien.Het rode vak geeft de vergroting aan die het contrast vergroot.Merk op dat de diameters van de magneetcircuits in alle figuren niet op schaal zijn en ongeveer 100 keer groter zijn dan weergegeven.
Terwijl de magneet naar links en rechts langs de bovenkant van het capillair beweegt, verandert de hoek van de MP-reeks om uit te lijnen met de magneet (zie figuur 6), waardoor de magnetische veldlijnen worden afgebakend.Voor MP3-5, nadat het akkoord de drempelhoek bereikt, slepen de deeltjes langs het bovenoppervlak van het capillair.Dit resulteert er vaak in dat parlementsleden zich clusteren in grotere groepen in de buurt van waar het magnetische veld het sterkst is (zie aanvullende video S3: MP5).Dit is ook vooral duidelijk bij beeldvorming dicht bij het einde van het capillair, waardoor de MP aggregeert en zich concentreert op de vloeistof-lucht-interface.De deeltjes in de MP6, die moeilijker te onderscheiden waren dan die in de MP3-5, sleepten niet toen de magneet langs het capillair bewoog, maar de MP-snaren dissocieerden, waardoor de deeltjes in beeld bleven (zie aanvullende video S4: MP6).In sommige gevallen, wanneer het aangelegde magnetische veld werd verminderd door de magneet over een lange afstand van de beeldlocatie te verplaatsen, daalden alle resterende MP's langzaam door de zwaartekracht naar het bodemoppervlak van de buis en bleven in de snaar (zie aanvullende video S5: MP3) .
De hoek van de MP-reeks verandert als de magneet naar rechts boven het capillair beweegt.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6.Het rode vak geeft de vergroting aan die het contrast vergroot.Houd er rekening mee dat de aanvullende video's voor informatieve doeleinden zijn, omdat ze belangrijke deeltjesstructuur en dynamische informatie onthullen die niet kan worden gevisualiseerd in deze statische afbeeldingen.
Onze tests hebben aangetoond dat het langzaam heen en weer bewegen van de magneet langs de luchtpijp de visualisatie van de MF vergemakkelijkt in de context van complexe beweging in vivo.Er werden geen in vivo tests uitgevoerd omdat de polystyreenbolletjes (MP1 en MP2) niet zichtbaar waren in het capillair.Elk van de overige vier MF's werd in vivo getest met de lange as van de magneet over de luchtpijp gepositioneerd in een hoek van ongeveer 30° ten opzichte van de verticaal (zie figuren 2b en 3a), omdat dit resulteerde in langere MF-ketens en effectiever was dan een magneet..configuratie beëindigd.MP3, MP4 en MP6 zijn niet gevonden in de luchtpijp van levende dieren.Bij het visualiseren van de luchtwegen van ratten na het op humane wijze doden van de dieren, bleven de deeltjes onzichtbaar, zelfs wanneer extra volume werd toegevoegd met behulp van een spuitpomp.MP5 had het hoogste ijzeroxidegehalte en was het enige zichtbare deeltje, dus werd het gebruikt om MP-gedrag in vivo te evalueren en te karakteriseren.
Plaatsing van de magneet over de luchtpijp tijdens het inbrengen van MF had tot gevolg dat veel, maar niet alle, MF's geconcentreerd waren in het gezichtsveld.Tracheale binnenkomst van deeltjes wordt het best waargenomen bij op humane wijze geëuthanaseerde dieren.Afbeelding 7 en aanvullende video S6: MP5 toont snelle magnetische vangst en uitlijning van deeltjes op het oppervlak van de ventrale luchtpijp, wat aangeeft dat MP's kunnen worden gericht op gewenste delen van de luchtpijp.Bij meer distaal zoeken langs de trachea na MF-toediening werden sommige MF's dichter bij de carina gevonden, wat wijst op onvoldoende magnetische veldsterkte om alle MF's te verzamelen en vast te houden, aangezien ze werden afgeleverd door het gebied met maximale magnetische veldsterkte tijdens vloeistoftoediening.werkwijze.Postnatale MP-concentraties waren echter hoger rond het beeldgebied, wat suggereert dat veel MP's in luchtweggebieden bleven waar de toegepaste magnetische veldsterkte het hoogst was.
Afbeeldingen van (a) voor en (b) na aflevering van MP5 in de luchtpijp van een onlangs geëuthanaseerde rat met een magneet net boven het beeldgebied.Het afgebeelde gebied bevindt zich tussen twee kraakbeenringen.Er zit wat vocht in de luchtwegen voordat de MP wordt afgeleverd.Het rode vak geeft de vergroting aan die het contrast vergroot.Deze afbeeldingen zijn afkomstig uit de video in S6: MP5 aanvullende video.
Het in vivo verplaatsen van de magneet langs de luchtpijp resulteerde in een verandering in de hoek van de MP-ketting op het luchtwegoppervlak, vergelijkbaar met die waargenomen in capillairen (zie afbeelding 8 en aanvullende video S7: MP5).In onze studie konden MP's echter niet langs het oppervlak van levende luchtwegen worden gesleept, zoals capillairen dat wel zouden kunnen.In sommige gevallen wordt de MP-ketting langer naarmate de magneet naar links en rechts beweegt.Interessant genoeg ontdekten we ook dat de deeltjesketting de diepte van de oppervlaktelaag van de vloeistof verandert wanneer de magneet longitudinaal langs de luchtpijp wordt bewogen, en uitzet wanneer de magneet recht boven het hoofd wordt bewogen en de deeltjesketting naar een verticale positie wordt gedraaid (zie Aanvullende video S7).: MP5 op 0:09, rechtsonder).Het karakteristieke bewegingspatroon veranderde wanneer de magneet zijdelings over de bovenkant van de luchtpijp werd bewogen (dwz links of rechts van het dier, in plaats van over de lengte van de luchtpijp).De deeltjes waren tijdens hun beweging nog steeds duidelijk zichtbaar, maar toen de magneet uit de luchtpijp werd verwijderd, werden de uiteinden van de deeltjesstrengen zichtbaar (zie aanvullende video S8: MP5, vanaf 0:08).Dit komt overeen met het waargenomen gedrag van het magnetische veld onder invloed van een aangelegd magnetisch veld in een glazen capillair.
Voorbeeldafbeeldingen van MP5 in de luchtpijp van een levend verdoofde rat.(a) De magneet wordt gebruikt om beelden boven en links van de luchtpijp te verkrijgen, vervolgens (b) nadat de magneet naar rechts is verplaatst.Het rode vak geeft de vergroting aan die het contrast vergroot.Deze afbeeldingen zijn afkomstig uit de video in de aanvullende video van S7: MP5.
Wanneer de twee polen werden afgestemd in een noord-zuid oriëntatie boven en onder de luchtpijp (dwz aantrekkend; Fig. 3b), leken de MP-akkoorden langer en bevonden zich op de laterale wand van de luchtpijp in plaats van op het dorsale oppervlak van de luchtpijp. luchtpijp (zie bijlage).video S9:MP5).Er werden echter geen hoge concentraties deeltjes op één plaats (dwz het dorsale oppervlak van de luchtpijp) gedetecteerd na vloeistoftoediening met behulp van een apparaat met dubbele magneet, wat gewoonlijk gebeurt met een apparaat met een enkele magneet.Toen één magneet was geconfigureerd om tegenovergestelde polen af ​​te stoten (figuur 3c), nam het aantal zichtbare deeltjes in het gezichtsveld na levering niet toe.Het opzetten van beide twee magneetconfiguraties is een uitdaging vanwege de hoge magnetische veldsterkte die de magneten respectievelijk aantrekt of duwt.De opstelling werd vervolgens gewijzigd in een enkele magneet evenwijdig aan de luchtwegen, maar die door de luchtwegen ging in een hoek van 90 graden, zodat de krachtlijnen de tracheale wand orthogonaal kruisten (figuur 3d), een oriëntatie bedoeld om de mogelijkheid van deeltjesaggregatie op de zijwand.Worden waargenomen.In deze configuratie was er echter geen identificeerbare MF-accumulatiebeweging of magneetbeweging.Op basis van al deze resultaten werd een configuratie met een enkele magneet en een oriëntatie van 30 graden gekozen voor in vivo studies van gendragers (figuur 3a).
Toen het dier onmiddellijk nadat het op humane wijze was opgeofferd, meerdere keren in beeld werd gebracht, betekende de afwezigheid van storende weefselbeweging dat fijnere, kortere deeltjeslijnen konden worden onderscheiden in het heldere interkraakbeenachtige veld, 'zwaaiend' in overeenstemming met de translatiebeweging van de magneet.zie duidelijk de aanwezigheid en beweging van MP6-deeltjes.
De titer van LV-LacZ was 1,8 x 108 IE/ml en na 1:1 mengen met CombiMag MP (MP6) werden de dieren geïnjecteerd met 50 µl van een tracheale dosis van 9 x 107 IE/ml LV-drager (dwz 4,5 IE/ml). x 106 TU/rat).).).In deze onderzoeken hebben we, in plaats van de magneet tijdens de bevalling te verplaatsen, de magneet in één positie gefixeerd om te bepalen of LV-transductie (a) kan worden verbeterd in vergelijking met vectorafgifte bij afwezigheid van een magnetisch veld, en (b) of de luchtweg zou kunnen wees geconcentreerd.De cellen worden getransduceerd in de magnetische doelgebieden van de bovenste luchtwegen.
De aanwezigheid van magneten en het gebruik van CombiMag in combinatie met LV-vectoren leken geen negatieve invloed te hebben op de diergezondheid, net als ons standaard LV-vectortoedieningsprotocol.Frontale beelden van het tracheale gebied onderworpen aan mechanische verstoring (aanvullende figuur 1) toonden aan dat de met LV-MP behandelde groep significant hogere niveaus van transductie had in de aanwezigheid van een magneet (figuur 9a).Slechts een kleine hoeveelheid blauwe LacZ-kleuring was aanwezig in de controlegroep (Figuur 9b).Kwantificering van met X-Gal gekleurde genormaliseerde gebieden toonde aan dat toediening van LV-MP in de aanwezigheid van een magnetisch veld resulteerde in een ongeveer 6-voudige verbetering (figuur 9c).
Voorbeeld van samengestelde beelden die tracheale transductie tonen met LV-MP (a) in aanwezigheid van een magnetisch veld en (b) in afwezigheid van een magneet.(c) Statistisch significante verbetering in het genormaliseerde gebied van LacZ-transductie in de luchtpijp met behulp van een magneet (*p = 0,029, t-test, n = 3 per groep, gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde).
Neutrale snel roodgekleurde secties (voorbeeld getoond in aanvullende figuur 2) gaven aan dat met LacZ gekleurde cellen aanwezig waren in hetzelfde monster en op dezelfde locatie als eerder gerapporteerd.
De belangrijkste uitdaging bij gentherapie van de luchtwegen blijft de precieze lokalisatie van dragerdeeltjes in interessegebieden en het bereiken van een hoog niveau van transductie-efficiëntie in de mobiele long in aanwezigheid van luchtstroom en actieve slijmopruiming.Voor LV-dragers die bedoeld zijn voor de behandeling van luchtwegaandoeningen bij cystische fibrose, was het tot nu toe een onbereikbaar doel om de verblijftijd van de dragerdeeltjes in de geleidende luchtwegen te verlengen.Zoals opgemerkt door Castellani et al., heeft het gebruik van magnetische velden om de transductie te verbeteren voordelen ten opzichte van andere methoden voor het afleveren van genen, zoals elektroporatie, omdat het eenvoud, economie, gelokaliseerde aflevering, verhoogde efficiëntie en kortere incubatietijd kan combineren.en mogelijk een lagere dosis vehiculum10.In vivo afzetting en gedrag van magnetische deeltjes in de luchtwegen onder invloed van externe magnetische krachten is echter nooit beschreven, en in feite is het vermogen van deze methode om genexpressieniveaus in intacte levende luchtwegen te verhogen niet in vivo aangetoond.
Onze in vitro-experimenten op de PCXI-synchrotron toonden aan dat alle deeltjes die we hebben getest, met uitzondering van het MP-polystyreen, zichtbaar waren in de beeldopstelling die we gebruikten.In aanwezigheid van een magnetisch veld vormen magnetische velden strings, waarvan de lengte gerelateerd is aan het type deeltjes en de sterkte van het magnetische veld (dwz de nabijheid en beweging van de magneet).Zoals te zien is in figuur 10, worden de snaren die we waarnemen gevormd wanneer elk afzonderlijk deeltje wordt gemagnetiseerd en zijn eigen lokale magnetische veld induceert.Deze afzonderlijke velden zorgen ervoor dat andere soortgelijke deeltjes zich verzamelen en zich verbinden met groepssnaarbewegingen als gevolg van lokale krachten van de lokale aantrekkings- en afstotingskrachten van andere deeltjes.
Diagram met (a, b) ketens van deeltjes die zich vormen in met vloeistof gevulde capillairen en (c, d) een met lucht gevulde luchtpijp.Merk op dat de haarvaten en luchtpijp niet op schaal zijn getekend.Paneel (a) bevat ook een beschrijving van de MF die in ketens gerangschikte Fe3O4-deeltjes bevat.
Toen de magneet over het capillair bewoog, bereikte de hoek van de deeltjesstreng de kritische drempel voor MP3-5 met Fe3O4, waarna de deeltjesstreng niet meer in zijn oorspronkelijke positie bleef, maar langs het oppervlak naar een nieuwe positie bewoog.magneet.Dit effect treedt waarschijnlijk op omdat het oppervlak van het glazen capillair glad genoeg is om deze beweging mogelijk te maken.Interessant genoeg gedroeg MP6 (CombiMag) zich niet op deze manier, misschien omdat de deeltjes kleiner waren, een andere coating of oppervlaktelading hadden, of omdat de gepatenteerde dragervloeistof hun bewegingsvermogen beïnvloedde.Het contrast in het CombiMag-deeltjesbeeld is ook zwakker, wat suggereert dat de vloeistof en deeltjes dezelfde dichtheid kunnen hebben en daarom niet gemakkelijk naar elkaar toe kunnen bewegen.Deeltjes kunnen ook vast komen te zitten als de magneet te snel beweegt, wat aangeeft dat de magnetische veldsterkte niet altijd de wrijving tussen deeltjes in de vloeistof kan overwinnen, wat suggereert dat de magnetische veldsterkte en de afstand tussen de magneet en het doelgebied niet als een verrassing.belangrijk.Deze resultaten geven ook aan dat hoewel magneten veel microdeeltjes kunnen vangen die door het doelgebied stromen, het onwaarschijnlijk is dat magneten betrouwbaar zijn om CombiMag-deeltjes langs het oppervlak van de luchtpijp te verplaatsen.We concludeerden dus dat in vivo LV MF-onderzoeken statische magnetische velden zouden moeten gebruiken om zich fysiek op specifieke delen van de luchtwegboom te richten.
Zodra de deeltjes in het lichaam zijn afgeleverd, zijn ze moeilijk te identificeren in de context van het complexe bewegende weefsel van het lichaam, maar hun detectievermogen is verbeterd door de magneet horizontaal over de luchtpijp te bewegen om de MP-snaren te "wiebelen".Hoewel real-time beeldvorming mogelijk is, is het gemakkelijker om deeltjesbeweging te onderscheiden nadat het dier op humane wijze is gedood.MP-concentraties waren meestal het hoogst op deze locatie als de magneet boven het beeldgebied was geplaatst, hoewel sommige deeltjes meestal verder in de luchtpijp werden gevonden.In tegenstelling tot in-vitro-onderzoek kunnen deeltjes niet door de luchtpijp worden meegesleurd door de beweging van een magneet.Deze bevinding komt overeen met hoe het slijm dat het oppervlak van de luchtpijp bedekt, typisch ingeademde deeltjes verwerkt, ze in het slijm opsluit en ze vervolgens opruimt via het muco-ciliaire klaringsmechanisme.
Onze hypothese was dat het gebruik van magneten boven en onder de luchtpijp voor aantrekking (fig. 3b) zou kunnen resulteren in een meer uniform magnetisch veld, in plaats van een magnetisch veld dat op één punt sterk geconcentreerd is, wat mogelijk resulteert in een meer uniforme verdeling van deeltjes..Onze voorlopige studie vond echter geen duidelijk bewijs om deze hypothese te ondersteunen.Evenzo resulteerde het instellen van een paar magneten om af te stoten (Fig. 3c) niet in meer bezinking van deeltjes in het beeldgebied.Deze twee bevindingen tonen aan dat de opstelling met dubbele magneet de lokale controle van MP-wijzen niet significant verbetert en dat de resulterende sterke magnetische krachten moeilijk af te stemmen zijn, waardoor deze benadering minder praktisch is.Evenzo verhoogde het oriënteren van de magneet boven en over de luchtpijp (Figuur 3d) ook niet het aantal deeltjes dat achterbleef in het afgebeelde gebied.Sommige van deze alternatieve configuraties zijn mogelijk niet succesvol omdat ze resulteren in een vermindering van de magnetische veldsterkte in de afzettingszone.De enkele magneetconfiguratie bij 30 graden (Fig. 3a) wordt dus beschouwd als de eenvoudigste en meest efficiënte in vivo testmethode.
De LV-MP-studie toonde aan dat wanneer LV-vectoren werden gecombineerd met CombiMag en werden afgeleverd nadat ze fysiek waren verstoord in de aanwezigheid van een magnetisch veld, de transductieniveaus significant toenamen in de luchtpijp in vergelijking met controles.Op basis van synchrotron-beeldvormingsonderzoeken en LacZ-resultaten bleek het magnetische veld in staat te zijn de LV in de luchtpijp te houden en het aantal vectordeeltjes te verminderen dat onmiddellijk diep in de long doordrong.Dergelijke targetingverbeteringen kunnen leiden tot een hogere efficiëntie terwijl de afgeleverde titers, niet-gerichte transductie, inflammatoire en immuunbijwerkingen en genoverdrachtskosten worden verlaagd.Belangrijk is dat CombiMag volgens de fabrikant kan worden gebruikt in combinatie met andere methoden voor genoverdracht, waaronder andere virale vectoren (zoals AAV) en nucleïnezuren.