Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden wij u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, zullen we de site in de tussentijd weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Toxoplasma gondii is een intracellulaire protozoaire parasiet die de micro-omgeving van de geïnfecteerde gastheer moduleert en waarvan bekend is dat deze geassocieerd is met de incidentie van hersentumorgroei.In deze studie veronderstellen we dat exosomaal miRNA-21 van een Toxoplasma-infectie de groei van hersentumoren bevordert.Exosomen van met Toxoplasma geïnfecteerde BV2-microglia werden gekarakteriseerd en internalisatie van U87-glioomcellen werd bevestigd.Exosomale microRNA-expressieprofielen werden geanalyseerd met behulp van arrays van microRNA en microRNA-21A-5p geassocieerd met Toxoplasma gondii en tumorsortering.We onderzochten ook de mRNA-niveaus van tumor-geassocieerde genen in U87-glioomcellen door miR-21-niveaus in exosomen te veranderen en het effect van exosomen op de proliferatie van menselijke U87-glioomcellen.In exosomen van U87-glioomcellen die zijn geïnfecteerd met Toxoplasma gondii, is de expressie van microRNA-21 verhoogd en is de activiteit van antitumorgenen (FoxO1, PTEN en PDCD4) verminderd.Van BV2 afkomstige exosomen geïnfecteerd met Toxoplasma induceren proliferatie van U87-glioomcellen.Exosomen induceren de groei van U87-cellen in een muistumormodel.We suggereren dat verhoogde exosomale miR-21 in met Toxoplasma geïnfecteerde BV2-microglia een belangrijke rol kan spelen als celgroeipromotor in U87-glioomcellen door antitumorgenen te downreguleren.
Er wordt geschat dat er in 2018 wereldwijd ruim 18,1 miljoen gevallen van gevorderde kanker zijn gediagnosticeerd, waarbij jaarlijks ongeveer 297.000 tumoren van het centrale zenuwstelsel worden gediagnosticeerd (1,6% van alle tumoren)1.Eerder onderzoek heeft aangetoond dat risicofactoren voor het ontwikkelen van menselijke hersentumoren verschillende chemische producten, familiegeschiedenis en ioniserende straling van therapeutische en diagnostische apparatuur van het hoofd omvatten.De exacte oorzaak van deze maligniteiten is echter onbekend.Ongeveer 20% van alle kankergevallen wereldwijd wordt veroorzaakt door infectieuze agentia, waaronder virussen, bacteriën en parasieten3,4.Infectieuze pathogenen verstoren de genetische mechanismen van de gastheercel, zoals DNA-reparatie en de celcyclus, en kunnen leiden tot chronische ontstekingen en schade aan het immuunsysteem5.
Infectieuze agentia die verband houden met kanker bij de mens zijn de meest voorkomende virale pathogenen, waaronder menselijke papillomavirussen en hepatitis B- en C-virussen.Parasieten kunnen ook een potentiële rol spelen bij de ontwikkeling van kanker bij de mens.Verschillende soorten parasieten, namelijk Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis en Hymenolepis nana, zijn betrokken bij verschillende soorten kanker bij de mens 6,7,8.
Toxoplasma gondii is een intracellulair protozoa dat de micro-omgeving van geïnfecteerde gastheercellen reguleert.Er wordt geschat dat deze parasiet ongeveer 30% van de wereldbevolking infecteert, waardoor de hele bevolking gevaar loopt9,10.Toxoplasma gondii kan vitale organen infecteren, waaronder het centrale zenuwstelsel (CZS), en ernstige ziekten veroorzaken zoals fatale meningitis en encefalitis, vooral bij immuungecompromitteerde patiënten9.Toxoplasma gondii kan echter ook de omgeving van de geïnfecteerde gastheer veranderen door de celgroei en immuunresponsen bij immunocompetente individuen te moduleren, wat leidt tot het in stand houden van een asymptomatische chronische infectie9,11.Interessant genoeg suggereren sommige rapporten, gezien de correlatie tussen de prevalentie van T. gondii en de incidentie van hersentumoren, dat in vivo veranderingen in de gastheeromgeving als gevolg van chronische T. gondii-infectie lijken op de micro-omgeving van de tumor.
Exosomen staan ​​bekend als intercellulaire communicators die biologische inhoud, waaronder eiwitten en nucleïnezuren, uit naburige cellen afleveren.Exosomen kunnen tumorgerelateerde biologische processen beïnvloeden, zoals anti-apoptose, angiogenese en metastase in de micro-omgeving van de tumor.In het bijzonder zijn miRNA's (miRNA's), kleine niet-coderende RNA's met een lengte van ongeveer 22 nucleotiden, belangrijke post-transcriptionele genregulatoren die meer dan 30% van het menselijke mRNA controleren via het miRNA-geïnduceerde silencing-complex (miRISC).Toxoplasma gondii kan biologische processen verstoren door de miRNA-expressie in geïnfecteerde gastheren te beheersen.Gastheer-miRNA's bevatten belangrijke signalen voor het reguleren van biologische processen van de gastheer om de overlevingsstrategie van de parasiet te bereiken.Het bestuderen van veranderingen in het miRNA-profiel van de gastheer na infectie met T. gondii kan ons dus helpen de interactie tussen de gastheer en T. gondii duidelijker te begrijpen.Thirugnanam et al.15 suggereerden dat T. gondii hersencarcinogenese bevordert door de expressie ervan op specifieke gastheer-miRNA's te veranderen die geassocieerd zijn met tumorgroei en ontdekten dat T. gondii gliomen kan veroorzaken bij proefdieren.
Deze studie richt zich op de verandering van exosomale miR-21 in gastheermicroglia geïnfecteerd met Toxoplasma BV2.We hebben een mogelijke rol waargenomen van veranderde exosomale miR-21 in de groei van U87-glioomcellen als gevolg van de retentie in de kern van FoxO1 / p27, het doelwit van tot overexpressie gebrachte miR-21.
Exosomen afgeleid van BV2 werden verkregen met behulp van differentiële centrifugatie en gevalideerd met verschillende methoden om besmetting met cellulaire componenten of andere blaasjes te voorkomen.SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) vertoonde duidelijke patronen tussen eiwitten geëxtraheerd uit BV2-cellen en exosomen (Figuur 1A), en monsters werden beoordeeld op de aanwezigheid van Alix, die werd geanalyseerd door Western-blotting van exosomale eiwitmarkers in .Alix-labeling werd gevonden in exosome-eiwitten, maar niet in BV2-cellysaateiwitten (Fig. 1B).Bovendien werd gezuiverd RNA uit exosomen afgeleid van BV2 geanalyseerd met behulp van een bioanalyzer.18S- en 28S-ribosomale subeenheden werden zelden waargenomen in het exosomale RNA-migratiepatroon, wat duidt op betrouwbare zuiverheid (Figuur 1C).Ten slotte toonde transmissie-elektronenmicroscopie aan dat de waargenomen exosomen ongeveer 60-150 nm groot waren en een komachtige structuur hadden die typisch is voor de exosoommorfologie (Fig. 1D).
Karakterisering van exosomen afgeleid van BV2-cellen.(A) Pagina met veiligheidsinformatieblad.Eiwitten werden geïsoleerd uit BV2-cellen of exosomen afgeleid van BV2.Eiwitpatronen verschillen tussen cellen en exosomen.(B) Western-blot-analyse van een exosomale marker (Alix).(C) Evaluatie van gezuiverd RNA uit BV2-cellen en uit BV2 afkomstige exosomen met behulp van een bioanalyzer.Zo werden 18S- en 28S-ribosomale subeenheden in BV2-cellen zelden aangetroffen in exosomaal RNA.(D) Transmissie-elektronenmicroscopie toonde aan dat exosomen geïsoleerd uit BV2-cellen negatief gekleurd waren met 2% uranylacetaat.Exosomen zijn ongeveer 60-150 nm groot en komvormig (Song en Jung, niet-gepubliceerde gegevens).
Cellulaire internalisatie van van BV2 afgeleide exosomen in U87 menselijke glioomcellen werd waargenomen met behulp van confocale microscopie.PKH26-gelabelde exosomen zijn gelokaliseerd in het cytoplasma van U87-cellen.Kernen werden gekleurd met DAPI (Fig. 2A), wat aangeeft dat van BV2 afkomstige exosomen kunnen worden geïnternaliseerd door gastheercellen en de omgeving van ontvangende cellen kunnen beïnvloeden.
Internalisatie van van BV2 afkomstige exosomen in U87-glioomcellen en van BV2 afkomstige exosomen geïnfecteerd met Toxoplasma RH-geïnduceerde proliferatie van U87-glioomcellen.(A) Exosomen overspoeld door U87-cellen gemeten met confocale microscopie.U87-glioomcellen werden 24 uur geïncubeerd met exosomen gelabeld met PKH26 (rood) of zonder controle.De kernen werden gekleurd met DAPI (blauw) en vervolgens waargenomen onder een confocale microscoop (schaalbalk: 10 μm, x 3000).(B) U87-glioomcelproliferatie werd bepaald door celproliferatietest.U87-glioomcellen werden gedurende de aangegeven tijd behandeld met exosomen. *P < 0,05 werd verkregen met Student's t-test. *P < 0,05 werd verkregen met Student's t-test. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0,05 volgens Student's t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P<0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 verkregen met behulp van Student's t-test.
Nadat we de internalisatie van van BV2 afkomstige exosomen in U87-glioomcellen hadden bevestigd, hebben we celproliferatietests uitgevoerd om de rol van van BV2 afkomstige, van Toxoplasma afkomstige exosomen in de ontwikkeling van menselijke glioomcellen te onderzoeken.Behandeling van U87-cellen met exosomen van met T. gondii geïnfecteerde BV2-cellen toonde aan dat met T. gondii geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen een significant hogere proliferatie van U87-cellen veroorzaakten vergeleken met controle (Fig. 2B).
Bovendien had de groei van U118-cellen dezelfde resultaten als die van U87, aangezien door Toxoplasma gestimuleerde exosomen de hoogste proliferatieniveaus veroorzaakten (gegevens niet getoond).Op basis van deze gegevens kunnen we aangeven dat met BV2 afkomstige, met Toxoplasma geïnfecteerde exosomen een belangrijke rol spelen bij de proliferatie van glioomcellen.
Om het effect van met Toxoplasma geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen op de tumorontwikkeling te onderzoeken, injecteerden we U87-glioomcellen in naakte muizen voor een xenotransplantaatmodel en injecteerden we van BV2 afkomstige exosomen of van RH geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen.Nadat tumoren na 1 week zichtbaar werden, werd elke experimentele groep van 5 muizen verdeeld op basis van tumorgrootte om hetzelfde uitgangspunt te bepalen, en werd de tumorgrootte gedurende 22 dagen gemeten.
Bij muizen met het U87 xenotransplantaatmodel werden op dag 22 significant grotere tumorgrootte en -gewicht waargenomen in de van BV2 afkomstige, met RH geïnfecteerde exosoomgroep (Fig. 3A, B).Aan de andere kant was er na exosoombehandeling geen significant verschil in tumorgrootte tussen de BV2-afgeleide exosoomgroep en de controlegroep.Bovendien vertoonden muizen geïnjecteerd met glioomcellen en exosomen visueel het grootste tumorvolume in de groep van RH-geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen (Fig. 3C).Deze resultaten tonen aan dat met BV2 afgeleide, met Toxoplasma geïnfecteerde exosomen glioomgroei induceren in een muistumormodel.
Oncogenese (AC) van van BV2 afkomstige exosomen in een U87 xenograft-muismodel.De tumorgrootte (A) en het gewicht (B) waren significant verhoogd bij naakte BALB/c-muizen behandeld met RH-geïnfecteerde exosomen afgeleid van BV2.BALB/c naakte muizen (C) werden subcutaan geïnjecteerd met 1 x 107 U87-cellen gesuspendeerd in Matrigel-mengsel.Zes dagen na injectie werd 100 μg van BV2 afgeleide exosomen behandeld bij muizen.De tumorgrootte en het gewicht werden respectievelijk op de aangegeven dagen en na het doden gemeten. *P<0,05. *P<0,05. *Р < 0,05. *P<0,05. *P <0,05。 *P <0,05。 *Р < 0,05. *P<0,05.
De gegevens toonden aan dat 37 miRNA's (16 tot overexpressie gebracht en 21 tot neerwaartse expressie gebracht) geassocieerd met immuniteit of tumorontwikkeling significant veranderd waren in microglia na infectie met de Toxoplasma RH-stam (Fig. 4A).Relatieve expressieniveaus van miR-21 onder veranderde miRNA's werden bevestigd door real-time RT-PCR in exosomen afgeleid van BV2, exosomen behandeld met BV2- en U87-cellen.Expressie van miR-21 vertoonde een significante toename in exosomen van BV2-cellen geïnfecteerd met Toxoplasma gondii (RH-stam) (Fig. 4B).De relatieve expressieniveaus van miR-21 in BV2- en U87-cellen namen toe na opname van veranderde exosomen (Fig. 4B).De relatieve niveaus van miR-21-expressie in de hersenweefsels van tumorpatiënten en muizen geïnfecteerd met Toxoplasma gondii (ME49-stam) waren respectievelijk hoger dan bij controles (Fig. 4C).Deze resultaten correleren met verschillen tussen de expressieniveaus van voorspelde en bevestigde microRNA's in vitro en in vivo.
Veranderingen in de expressie van exosomale miP-21a-5p in microglia geïnfecteerd met Toxoplasma gondii (RH).(A) Toont significante veranderingen aan in siRNA geassocieerd met immuniteit of tumorontwikkeling na T. gondii RH-infectie.(B) Relatieve miR-21-expressieniveaus werden gedetecteerd door real-time RT-PCR in van BV2 afkomstige exosomen, met BV2 behandelde exosomen en U87-cellen.(C) Relatieve miR-21-expressieniveaus werden gevonden in de hersenweefsels van tumorpatiënten (N=3) en muizen geïnfecteerd met Toxoplasma gondii (ME49-stam) (N=3). *P < 0,05 werd verkregen met Student's t-test. *P < 0,05 werd verkregen met Student's t-test. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 werd verkregen met behulp van Student's t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P<0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 verkregen met behulp van Student's t-test.
Exosomen van met RH geïnfecteerde BV2-cellen leidden tot de groei van gliomen in vivo en in vitro (Fig. 2, 3).Om relevante mRNA's te detecteren, onderzochten we mRNA-niveaus van antitumordoelgenen, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN en geprogrammeerde celdood 4 (PDCD4) in U87-cellen geïnfecteerd met exosomen afgeleid van BV2 of RH BV2.Bio-informatica-analyse heeft aangetoond dat verschillende tumor-geassocieerde genen, waaronder de FoxO1-, PTEN- en PDCD4-genen, miR-2121,22-bindingsplaatsen hebben.mRNA-niveaus van antitumordoelgenen waren verlaagd in met RH geïnfecteerde, van BV2 afkomstige exosomen vergeleken met van BV2 afkomstige exosomen (Fig. 5A).FoxO1 vertoonde verlaagde eiwitniveaus in met RH geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen vergeleken met BV2-afgeleide exosomen (Figuur 5B).Op basis van deze resultaten konden we bevestigen dat exosomen afgeleid van met RH geïnfecteerde BV2 anti-oncogene genen downreguleren, waardoor hun rol in de tumorgroei behouden blijft.
Toxoplasma RH-geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen induceren onderdrukking van antitumorgenen in U87-glioomcellen door Toxoplasma RH-geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen.(A) Real-time PCR van FoxO1-, PTEN- en PDCD4-expressie in exosomen afgeleid van met T. gondii RH-geïnfecteerde BV2 vergeleken met PBS-exosomen.β-actine-mRNA werd als controle gebruikt.(B) FoxO1-expressie werd bepaald door Western-blotting en densitometriegegevens werden statistisch geëvalueerd met behulp van het ImageJ-programma. *P < 0,05 werd verkregen met Student's t-test. *P < 0,05 werd verkregen met Student's t-test. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 werd verkregen met behulp van Student's t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P<0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 verkregen met behulp van Student's t-test.
Om het effect van miP-21 in exosomen op tumor-geassocieerde genregulatie te begrijpen, werden U87-cellen getransfecteerd met een remmer van miP-21 met behulp van Lipofectamine 2000 en werden de cellen 24 uur na transfectie geoogst.FoxO1- en p27-expressieniveaus in cellen getransfecteerd met miR-21-remmers werden vergeleken met cellen behandeld met van BV2 afgeleide exosomen met behulp van qRT-PCR (Fig. 6A, B).Transfectie van de miR-21-remmer in U87-cellen verlaagde de FoxO1- en p27-expressie aanzienlijk (Fig. 6).
RH-geïnfecteerde exosomale BV2-afgeleide miP-21 veranderde FoxO1 / p27-expressie in U87-glioomcellen.U87-cellen werden getransfecteerd met miP-21-remmer met behulp van Lipofectamine 2000 en cellen werden 24 uur na transfectie geoogst.FoxO1- en p27-expressieniveaus in cellen getransfecteerd met miR-21-remmers werden vergeleken met niveaus in cellen behandeld met van BV2 afgeleide exosomen met behulp van qRT-PCR (A, B).
Om aan de immuunreactie van de gastheer te ontsnappen, verandert de Toxoplasma-parasiet in een weefselcyste.Ze parasiteren verschillende weefsels, waaronder de hersenen, het hart en de skeletspieren, gedurende de hele levensduur van de gastheer en moduleren de immuunrespons van de gastheer.Bovendien kunnen ze de celcyclus en apoptose van gastheercellen reguleren, waardoor hun proliferatie wordt bevorderd14,24.Toxoplasma gondii infecteert voornamelijk dendritische cellen van de gastheer, neutrofielen en monocyten/macrofagen, inclusief hersenmicroglia.Toxoplasma gondii induceert de differentiatie van macrofagen van het M2-fenotype, beïnvloedt de wondgenezing na infectie met pathogenen en wordt ook geassocieerd met hypervascularisatie en granulomateuze fibrose.Deze gedragspathogenese van Toxoplasma-infectie kan verband houden met markers die geassocieerd zijn met tumorontwikkeling.De vijandige omgeving die door Toxoplasma wordt gereguleerd, kan lijken op de overeenkomstige prekanker.Daarom kan worden aangenomen dat Toxoplasma-infectie zou moeten bijdragen aan de ontwikkeling van hersentumoren.Er zijn zelfs hoge percentages Toxoplasma-infecties gemeld in het serum van patiënten met verschillende hersentumoren.Bovendien kan Toxoplasma gondii een andere carcinogene effector zijn en synergetisch werken om andere infectieuze carcinogenen te helpen hersentumoren te ontwikkelen.In dit opzicht is het vermeldenswaard dat P. falciparum en het Epstein-Barr-virus synergetisch bijdragen aan de vorming van Burkitt-lymfoom.
De rol van exosomen als toezichthouders op het gebied van kankeronderzoek is uitgebreid onderzocht.De rol van exosomen tussen parasieten en geïnfecteerde gastheren blijft echter slecht begrepen.Tot nu toe hebben verschillende toezichthouders, waaronder uitgescheiden eiwitten, de biologische processen verklaard waarmee protozoaire parasieten zich verzetten tegen aanvallen van de gastheer en de infectie in stand houden.Onlangs is er een groeiend concept ontstaan ​​dat met protozoën geassocieerde microvesicles en hun microRNA's interageren met gastheercellen om een ​​gunstige omgeving voor hun overleving te creëren.Daarom zijn verdere studies nodig om de relatie tussen veranderde exosomale miRNA's en glioomcelproliferatie te ontdekken.MicroRNA-verandering (clustergenen miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 en miR-17-92) bindt aan de STAT3-promoter in met toxoplasma geïnfecteerde menselijke macrofagen, wordt gereguleerd en induceert -apoptose als reactie op Toxoplasma gondii-infectie 29 .Toxoplasma-infectie verhoogt de expressie van miR-17-5p en miR-106b-5p, die geassocieerd zijn met verschillende hyperproliferatieve ziekten 30 .Deze gegevens suggereren dat gastheer-miRNA's gereguleerd door Toxoplasma-infectie belangrijke moleculen zijn voor de overleving van parasieten en pathogenese in het biologische gedrag van de gastheer.
Veranderde miRNA's kunnen verschillende soorten gedrag beïnvloeden tijdens de initiatie en progressie van kwaadaardige cellen, waaronder gliomen: zelfvoorziening van groeisignalen, ongevoeligheid voor groeiremmende signalen, ontwijking van apoptose, onbeperkt replicatiepotentieel, angiogenese, invasie en metastase, en ontsteking.Bij glioom zijn veranderde miRNA's geïdentificeerd in verschillende expressieprofileringsstudies.
In de huidige studie bevestigden we hoge niveaus van miRNA-21-expressie in met toxoplasma geïnfecteerde gastheercellen.miR-21 is geïdentificeerd als een van de meest frequent tot overexpressie gebrachte microRNA's in solide tumoren, waaronder gliomen, 33 en de expressie ervan correleert met de graad van glioom.Er is steeds meer bewijs dat miR-21 een nieuw oncogen is dat werkt als een anti-apoptotische factor bij de groei van gliomen en dat het in hoge mate tot overexpressie komt in weefsels en plasma van menselijke hersenmaligniteiten.Interessant is dat miR-21-inactivatie in glioomcellen en weefsels de remming van celproliferatie veroorzaakt als gevolg van caspase-afhankelijke apoptose.Bio-informatica-analyse van door miR-21 voorspelde doelen onthulde meerdere tumorsuppressorgenen geassocieerd met apoptose-routes, waaronder geprogrammeerde celdood 4 (PDCD4), tropomyosine (TPM1), PTEN en forkhead box O1 (FoxO1), met de miR-2121-bindingsplaats..22.38.
FoxO1 is als een van de transcriptiefactoren (FoxO) betrokken bij de ontwikkeling van verschillende soorten kanker bij de mens en kan de expressie van tumorsuppressorgenen zoals p21, p27, Bim en FasL40 reguleren.FoxO1 kan celcyclusremmers zoals p27 binden en activeren om de celgroei te onderdrukken.Bovendien is FoxO1 een belangrijke effector van PI3K/Akt-signalering en reguleert het vele biologische processen zoals celcyclusprogressie en celdifferentiatie door activering van p2742-transcriptie.
Concluderend zijn wij van mening dat exosomaal miR-21 afgeleid van met Toxoplasma geïnfecteerde microglia een belangrijke rol kan spelen als groeiregulator van glioomcellen (Fig. 7).Er zijn echter verdere studies nodig om een ​​direct verband te vinden tussen exosomale miR-21, veranderde Toxoplasma-infectie en glioomgroei.Verwacht wordt dat deze resultaten een startpunt zullen vormen voor het bestuderen van de relatie tussen Toxoplasma-infectie en de incidentie van glioom.
In deze studie wordt een schematisch diagram voorgesteld van het mechanisme van glioomcarcinogenese (hersencarcinogenese).De auteur tekent in PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Alle experimentele protocollen in dit onderzoek, inclusief het gebruik van dieren, waren in overeenstemming met de standaard ethische richtlijnen van de Seoul National University Animal Care and User Committee en werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Seoul National University School of Medicine (IRB-nummer SNU- 150715).-2).Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-aanbevelingen.
BV2-muismicroglia en U87 menselijke glioomcellen werden gekweekt in respectievelijk Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) en Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), elk met 10% foetaal runderserum, 4 mM l- glutamine, 0,2 mM penicilline en 0,05 mM streptomycine.Cellen werden gekweekt in een incubator met 5% CO2 bij 37°C.Een andere glioomcellijn, U118, werd gebruikt voor vergelijking met U87-cellen.
Om exosomen te isoleren van met T. gondii geïnfecteerde RH- en ME49-stammen, werden T. gondii-tachyzoieten (RH-stam) geoogst uit de buikholte van 6 weken oude BALB/c-muizen die 3-4 dagen eerder waren geïnjecteerd.Tachyzoïeten werden driemaal gewassen met PBS en gezuiverd door centrifugatie in 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS)43.Om tachyzoïeten van stam ME49 te verkrijgen, werden BALB/c-muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met 20 weefselcysten en werd tachyzoïetentransformatie in cysten verzameld door de buikholte te wassen op de 6-8e dag na infectie (PI).Muizen besmet met PBS.ME49-tachyzoïeten werden gekweekt in cellen aangevuld met 100 μg/ml penicilline (Gibco/BRL, Grand Island, NY, VS), 100 μg/ml streptomycine (Gibco/BRL) en 5% foetaal runderserum (Lonza, Walkersville, MD). .., VS) bij 37 °C en 5% kooldioxide.Na kweken in Vero-cellen werden ME49-tachyzoieten tweemaal door een naald van 25 gauge en vervolgens door een filter van 5 µm gevoerd om afval en cellen te verwijderen.Na wassen werden de tachyzoïeten opnieuw gesuspendeerd in PBS44.Weefselcysten van Toxoplasma gondii-stam ME49 werden in stand gehouden door intraperitoneale injectie van cysten geïsoleerd uit de hersenen van geïnfecteerde C57BL / 6-muizen (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).De hersenen van met ME49 geïnfecteerde muizen werden na 3 maanden PI geoogst en onder een microscoop fijngehakt om cysten te isoleren.De geïnfecteerde muizen werden onder speciale pathogeenvrije omstandigheden (SPF) gehouden aan de Seoul National University School of Medicine.
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit van BV2 afkomstige exosomen, BV2-cellen en weefsels met behulp van de miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant, inclusief de incubatietijd voor de elutiestap.De RNA-concentratie werd bepaald op een NanoDrop 2000 spectrofotometer.De kwaliteit van RNA-microarrays werd beoordeeld met behulp van een Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Amstelveen, Nederland).
DMEM met 10% exosoomarme FBS werd bereid door ultracentrifugatie bij 100.000 g gedurende 16 uur bij 4 ° C en gefiltreerd door een filter van 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, VS).BV2-cellen, 5 x 105, werden gekweekt in DMEM met 10% exosoom-verarmde FBS en 1% antibiotica bij 37 ° C en 5% CO2.Na 24 uur incubatie werden tachyzoïeten van stam RH of ME49 (MOI = 10) aan de cellen toegevoegd en niet-binnendringende parasieten werden binnen een uur verwijderd en opnieuw gevuld met DMEM.Exosomen uit BV2-cellen werden geïsoleerd door gemodificeerde differentiële centrifugatie, de meest gebruikte methode.Resuspendeer de exosoompellet in 300 µl PBS voor RNA- of eiwitanalyse.De concentratie van geïsoleerde exosomen werd bepaald met behulp van een BCA-eiwittestkit (Pierce, Rockford, IL, VS) en een NanoDrop 2000-spectrofotometer.
Neerslagen van BV2-cellen of exosomen afgeleid van BV2 werden gelyseerd in PRO-PREP™ eiwitextractieoplossing (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) en eiwitten werden geladen op Coomassie briljant blauw gekleurde 10% SDS-polyacrylamidegels.Bovendien werden eiwitten gedurende 2 uur overgebracht naar PVDF-membranen.Western-blots werden gevalideerd met behulp van het Alix-antilichaam (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS) als een exosomale marker.HRP-geconjugeerd geit-anti-muis IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, VS) en een LAS-1000 plus luminescerende beeldanalysator (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) werden gebruikt als een secundair antilichaam..Transmissie-elektronenmicroscopie werd uitgevoerd om de grootte en morfologie van exosomen te bestuderen.Exosomen geïsoleerd uit BV2-cellen (6,40 μg/μl) werden bereid op met koolstof beklede mazen en gedurende 1 minuut negatief gekleurd met 2% uranylacetaat.De bereide monsters werden waargenomen bij een versnellingsspanning van 80 kV met behulp van een JEOL 1200-EX II (Tokio, Japan) uitgerust met een ES1000W Erlangshen CCD-camera (Gatan, Pleasanton, CA, VS).
Van BV2 afkomstige exosomen werden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gekleurd met behulp van de PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS).U87-cellen, 2 x 105, met PKH26-gelabelde exosomen (rood) of geen exosomen als negatieve controle, werden 24 uur bij 37 ° C geïncubeerd in een incubator met 5% CO2.U87-celkernen werden gekleurd met DAPI (blauw), U87-cellen werden 15 minuten bij 4 ° C gefixeerd in 4% paraformaldehyde en vervolgens geanalyseerd in een Leica TCS SP8 STED CW confocaal microscoopsysteem (Leica Microsystems, Mannheim, Duitsland).waarneembaar.
cDNA werd gesynthetiseerd uit siRNA met behulp van Mir-X siRNA eerste strengsynthese en SYBR qRT-PCR-kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Real-time kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met behulp van het iQ5 real-time PCR-detectiesysteem (Bio-Rad, Hercules, CA, VS) met behulp van primers en sjablonen gemengd met SYBR Premix.DNA werd geamplificeerd gedurende 40 cycli van denaturatie bij 95°C gedurende 15 seconden en annealing bij 60°C gedurende 60 seconden.De gegevens van elke PCR-reactie werden geanalyseerd met behulp van de data-analysemodule van de iQ™5 optische systeemsoftware (Bio-Rad).Relatieve veranderingen in genexpressie tussen geselecteerde doelgenen en β-actine/siRNA (en U6) werden berekend met behulp van de standaardcurvemethode.De gebruikte primersequenties worden getoond in Tabel 1.
3 x 104 U87-glioomcellen werden gezaaid in platen met 96 putjes en gemengd met met Toxoplasma geïnfecteerde exosomen afgeleid van BV2 (50 μg/ml) of niet-pulse exosomen afgeleid van BV2 (50 μg/ml) als controles na 12, 18 en 36 uur .De celproliferatiesnelheid werd bepaald met behulp van de Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (aanvullende figuren S1-S3) 46.
5 weken oude vrouwelijke BALB/c naakte muizen werden gekocht bij Orient Bio (Seongnam-si, Zuid-Korea) en individueel gehouden in steriele kooien bij kamertemperatuur (22 ± 2°C) en vochtigheid (45 ± 15°C).%) bij kamertemperatuur (22±2°C) en vochtigheid (45±15%).Een lichtcyclus van 12 uur en een donkercyclus van 12 uur werden uitgevoerd onder SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Muizen werden willekeurig verdeeld in drie groepen van elk 5 muizen en alle groepen werden subcutaan geïnjecteerd met 400 ml PBS met 1 x 107 U87-glioomcellen en met groeifactor gereduceerde BD MatrigelTM (BD Science, Miami, FL, VS).Zes dagen na de tumorinjectie werd 200 mg exosomen afgeleid van BV2-cellen (met/zonder Toxoplasma-infectie) in de tumorplaats geïnjecteerd.Tweeëntwintig dagen na de tumorinfectie werd de tumorgrootte van muizen in elke groep driemaal per week gemeten met een schuifmaat, en het tumorvolume werd berekend met de formule: 0,5 x (breedte) x 2 x lengte.
MicroRNA-expressieanalyse met behulp van miRCURYTM LNA miRNA-array, 7e generatie has-, mmu- en rno-arrays (EXIQON, Vedbaek, Denemarken) die 1119 goed gekarakteriseerde muizen omvatten onder 3100 miRNA-vangsondes voor mensen, muizen en ratten.Tijdens deze procedure werd 250 tot 1000 ng totaal RNA uit het 5'-fosfaat verwijderd door behandeling met alkalische fosfatase uit kalfsdarm gevolgd door labeling met Hy3 groene fluorescerende kleurstof.De gelabelde monsters werden vervolgens gehybridiseerd door microarray-glaasjes te laden met behulp van een hybridisatiekamerkit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, VS) en een hybridisatieglaasjeskit (Agilent Technologies).De hybridisatie werd gedurende 16 uur bij 56°C uitgevoerd, waarna de microarrays werden gewassen in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant.De verwerkte microarray-glaasjes werden vervolgens gescand met behulp van een Agilent G2565CA microarray-scannersysteem (Agilent Technologies).Gescande afbeeldingen werden geïmporteerd met behulp van Agilent Feature Extraction-softwareversie 10.7.3.1 (Agilent Technologies) en de fluorescentie-intensiteit van elke afbeelding werd gekwantificeerd met behulp van het overeenkomstige GAL-bestand van het aangepaste Exiqon-protocol.Microarraygegevens voor het huidige onderzoek zijn gedeponeerd in de GEO-database onder toegangsnummer GPL32397.
Expressieprofielen van volwassen exosomale miRNA's in microglia van RH- of ME49-stammen geïnfecteerd met Toxoplasma werden geanalyseerd met behulp van verschillende netwerktools.miRNA's geassocieerd met tumorontwikkeling werden geïdentificeerd met behulp van miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) en uitgefilterd met een genormaliseerde signaalintensiteit (log2) groter dan 8,0.Van de miRNA's bleek dat de differentieel tot expressie gebrachte miRNA's meer dan 1,5 keer veranderd waren door filteranalyse van miRNA's die veranderd waren door RH- of ME49-stammen geïnfecteerd met T. gondii.
Cellen werden gezaaid in platen met zes putjes (3 x 105 cellen / putje) in opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, VS) met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS).De getransfecteerde cellen werden gedurende 6 uur gekweekt en vervolgens werd het medium vervangen door vers compleet medium.Cellen werden 24 uur na transfectie geoogst.
Statistische analyse werd voornamelijk uitgevoerd met behulp van Student's t-test met Excel-software (Microsoft, Washington, DC, VS).Voor experimentele dieranalyse werd een tweeweg-ANOVA uitgevoerd met behulp van Prism 3.0-software (GraphPad Software, La Jolla, CA, VS). P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-waarden <0,05 werden als statistisch significant beschouwd. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-waarden <0,05 werden als statistisch significant beschouwd.
Alle experimentele protocollen die in dit onderzoek werden gebruikt, werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Seoul National University School of Medicine (IRB-nummer SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Geschatte mondiale kankerincidentie en -sterfte in 2018: GLOBOCAN-bronnen en -methoden.Interpretatie.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Een inzicht in de risicofactoren van hersentumoren en hun therapeutische interventies. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Een inzicht in de risicofactoren van hersentumoren en hun therapeutische interventies.Rashid, S., Rehman, K. en Akash, MS Een overzicht van risicofactoren voor hersentumoren en belangrijke therapeutische interventies. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Diep inzicht in risicofactoren voor hersentumoren en therapeutische interventies.Rashid, S., Rehman, K. en Akash, MS Een overzicht van risicofactoren voor hersentumoren en belangrijke therapeutische interventies.Biomedische wetenschappen.Apotheker.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacterieel-virale interacties bij menselijke orodigestieve en vrouwelijke geslachtsorganen: een samenvatting van epidemiologisch en laboratoriumbewijs. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacterieel-virale interacties bij menselijke orodigestieve en vrouwelijke geslachtsorganen: een samenvatting van epidemiologisch en laboratoriumbewijs.Kato I., Zhang J. en Sun J. Bacterieel-virale interacties bij kanker van het menselijke maagdarmkanaal en het vrouwelijke geslachtsorgaan: een samenvatting van epidemiologische en laboratoriumgegevens. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.据总结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacterio-virale interactie bij de spijsvertering van de menselijke mondholte en het vrouwelijke voortplantingsstelsel: samenvatting van populaire ziektewetenschap en laboratoriumbewijs.Kato I., Zhang J. en Sun J. Bacterieel-virale interacties bij maag-darmkanker bij de mens en vrouwelijke genitale kanker: een samenvatting van epidemiologische en laboratoriumgegevens.Kreeft 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Van infectie tot kanker: hoe DNA-tumorvirussen het centrale koolstof- en lipidemetabolisme van de gastheercel veranderen. Magon, KL & Parish, JL Van infectie tot kanker: hoe DNA-tumorvirussen het centrale koolstof- en lipidemetabolisme van de gastheercel veranderen.Mahon, KL en Parish, JL Brandinfectie bij kanker: hoe op DNA gebaseerde tumorvirussen het centrale koolstof- en lipidemetabolisme van de gastheercel veranderen. Magon, KL & Parish, JL Magon, KL & Parish, JL Van infectie tot kanker: hoe DNA-tumorvirussen het centrale koolstof- en lipidemetabolisme van de gastheercel veranderen.Mahon, KL en Parish, JL Vuurt infectie op kanker: hoe DNA-tumorvirussen het centrale koolstof- en lipidemetabolisme in gastheercellen veranderen.Open Biologie.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Catechol-oestrogenen van schistosomen en leverbotten en helminth-geassocieerde kanker.voorkant.heet van binnen.5, 444 (2014).