Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).In de tussentijd zullen we, om voortdurende ondersteuning te garanderen, de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Toxoplasma gondii is een intracellulaire protozoaire parasiet die de micro-omgeving van de geïnfecteerde gastheer moduleert en waarvan bekend is dat deze geassocieerd is met de incidentie van hersentumorgroei.In deze studie veronderstellen we dat exosomaal miRNA-21 van Toxoplasma-infectie de groei van hersentumoren bevordert.Exosomen van met Toxoplasma geïnfecteerde BV2-microglia werden gekarakteriseerd en internalisatie van U87-glioomcellen werd bevestigd.Exosomale microRNA-expressieprofielen werden geanalyseerd met behulp van arrays van microRNA en microRNA-21A-5p geassocieerd met Toxoplasma gondii en tumorsortering.We onderzochten ook de mRNA-niveaus van tumor-geassocieerde genen in U87-glioomcellen door miR-21-niveaus in exosomen te veranderen en het effect van exosomen op de proliferatie van menselijke U87-glioomcellen.In exosomen van U87-glioomcellen die zijn geïnfecteerd met Toxoplasma gondii, is de expressie van microRNA-21 verhoogd en is de activiteit van antitumorgenen (FoxO1, PTEN en PDCD4) verminderd.Van BV2 afgeleide exosomen geïnfecteerd met Toxoplasma induceren proliferatie van U87-gliomacellen.Exosomen induceren de groei van U87-cellen in een muizentumormodel.We suggereren dat verhoogde exosomale miR-21 in Toxoplasma-geïnfecteerde BV2-microglia een belangrijke rol kan spelen als celgroeipromotor in U87-glioomcellen door antitumorgenen te downreguleren.
Naar schatting werden in 2018 wereldwijd meer dan 18,1 miljoen gevallen van kanker in een gevorderd stadium gediagnosticeerd, waarbij jaarlijks ongeveer 297.000 tumoren van het centrale zenuwstelsel werden gediagnosticeerd (1,6% van alle tumoren)1.Eerder onderzoek heeft aangetoond dat risicofactoren voor het ontwikkelen van menselijke hersentumoren verschillende chemische producten, familiegeschiedenis en ioniserende straling van therapeutische en diagnostische apparatuur voor het hoofd omvatten.De exacte oorzaak van deze maligniteiten is echter onbekend.Ongeveer 20% van alle kankers wereldwijd wordt veroorzaakt door infectieuze agentia, waaronder virussen, bacteriën en parasieten3,4.Infectieuze pathogenen verstoren de genetische mechanismen van de gastheercel, zoals DNA-herstel en de celcyclus, en kunnen leiden tot chronische ontsteking en schade aan het immuunsysteem5.
Infectieuze agentia die geassocieerd zijn met kanker bij de mens zijn de meest voorkomende virale pathogenen, waaronder humaan papillomavirussen en hepatitis B- en C-virussen.Parasieten kunnen ook een potentiële rol spelen bij de ontwikkeling van kanker bij de mens.Verschillende soorten parasieten, namelijk Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis en Hymenolepis nana, zijn betrokken bij verschillende soorten kanker bij de mens 6,7,8.
Toxoplasma gondii is een intracellulair protozoa dat de micro-omgeving van geïnfecteerde gastheercellen reguleert.Naar schatting infecteert deze parasiet ongeveer 30% van de wereldbevolking, waardoor de hele bevolking gevaar loopt9,10.Toxoplasma gondii kan vitale organen infecteren, waaronder het centrale zenuwstelsel (CZS), en ernstige ziekten veroorzaken, zoals dodelijke meningitis en encefalitis, vooral bij immuungecompromitteerde patiënten9.Toxoplasma gondii kan echter ook de omgeving van de geïnfecteerde gastheer veranderen door celgroei en immuunresponsen bij immunocompetente individuen te moduleren, wat leidt tot het in stand houden van een asymptomatische chronische infectie9,11.Interessant is dat, gezien de correlatie tussen de prevalentie van T. gondii en de incidentie van hersentumoren, sommige rapporten suggereren dat in vivo omgevingsveranderingen van de gastheer als gevolg van chronische T. gondii-infectie lijken op de micro-omgeving van de tumor.
Exosomen staan ​​bekend als intercellulaire communicatoren die biologische inhoud leveren, inclusief eiwitten en nucleïnezuren, van naburige cellen16,17.Exosomen kunnen tumorgerelateerde biologische processen beïnvloeden, zoals anti-apoptose, angiogenese en metastase in de micro-omgeving van de tumor.Met name miRNA's (miRNA's), kleine niet-coderende RNA's van ongeveer 22 nucleotiden lang, zijn belangrijke post-transcriptionele genregulatoren die meer dan 30% van het menselijke mRNA controleren via het miRNA-geïnduceerde silencing-complex (miRISC).Toxoplasma gondii kan biologische processen verstoren door miRNA-expressie in geïnfecteerde gastheren te beheersen.Gastheer-miRNA's bevatten belangrijke signalen voor het reguleren van biologische gastheerprocessen om de overlevingsstrategie van de parasiet te bereiken.Het bestuderen van veranderingen in het miRNA-profiel van de gastheer na infectie met T. gondii kan ons dus helpen de interactie tussen de gastheer en T. gondii beter te begrijpen.Thirugnanam et al.suggereerde dat T. gondii hersencarcinogenese bevordert door de expressie ervan op specifieke miRNA's van de gastheer die geassocieerd zijn met tumorgroei te veranderen en ontdekte dat T. gondii gliomen kan veroorzaken bij proefdieren.
Deze studie richt zich op de wijziging van exosomale miR-21 in microglia van de gastheer die zijn geïnfecteerd met Toxoplasma BV2.We hebben een mogelijke rol waargenomen van veranderde exosomale miR-21 in de groei van U87-glioomcellen vanwege de retentie in de kern van FoxO1 / p27, het doelwit van tot overexpressie gebrachte miR-21.
Exosomen afgeleid van BV2 werden verkregen met behulp van differentiële centrifugatie en gevalideerd door verschillende methoden om besmetting met cellulaire componenten of andere blaasjes te voorkomen.SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) vertoonde duidelijke patronen tussen eiwitten geëxtraheerd uit BV2-cellen en exosomen (Figuur 1A), en monsters werden beoordeeld op de aanwezigheid van Alix, die werd geanalyseerd door Western-blotting van exosomale eiwitmarkers in .Alix-labeling werd gevonden in exosoom-eiwitten maar niet in BV2-cellysaat-eiwitten (figuur 1B).Bovendien werd gezuiverd RNA van exosomen afgeleid van BV2 geanalyseerd met behulp van een bioanalysator.18S- en 28S-ribosomale subeenheden werden zelden waargenomen in het exosomale RNA-migratiepatroon, wat wijst op een betrouwbare zuiverheid (Figuur 1C).Ten slotte toonde transmissie-elektronenmicroscopie aan dat de waargenomen exosomen ongeveer 60-150 nm groot waren en een komachtige structuur hadden die typerend is voor exosoommorfologie (Fig. 1D).
Karakterisering van exosomen afgeleid van BV2-cellen.(A) Pagina veiligheidsinformatieblad.Eiwitten werden geïsoleerd uit BV2-cellen of exosomen afgeleid van BV2.Eiwitpatronen verschillen tussen cellen en exosomen.(B) Western-blotanalyse van een exosomale marker (Alix).(C) Evaluatie van gezuiverd RNA uit BV2-cellen en BV2-afgeleide exosomen met behulp van een bioanalysator.Aldus werden 18S- en 28S-ribosomale subeenheden in BV2-cellen zelden gevonden in exosomaal RNA.(D) Transmissie-elektronenmicroscopie toonde aan dat exosomen geïsoleerd uit BV2-cellen negatief gekleurd waren met 2% uranylacetaat.Exosomen zijn ongeveer 60-150 nm groot en komvormig (Song en Jung, niet-gepubliceerde gegevens).
Cellulaire internalisatie van BV2-afgeleide exosomen in U87 menselijke glioomcellen werd waargenomen met behulp van confocale microscopie.PKH26-gelabelde exosomen zijn gelokaliseerd in het cytoplasma van U87-cellen.Kernen werden gekleurd met DAPI (Fig. 2A), wat aangeeft dat van BV2 afgeleide exosomen kunnen worden geïnternaliseerd door gastheercellen en de omgeving van ontvangende cellen kunnen beïnvloeden.
Internalisatie van BV2-afgeleide exosomen in U87-glioomcellen en BV2-afgeleide exosomen geïnfecteerd met Toxoplasma RH geïnduceerde proliferatie van U87-glioomcellen.(A) Exosomen verzwolgen door U87-cellen gemeten met confocale microscopie.U87-glioomcellen werden gedurende 24 uur geïncubeerd met exosomen gelabeld met PKH26 (rood) of zonder controle.De kernen werden gekleurd met DAPI (blauw) en vervolgens waargenomen onder een confocale microscoop (schaalbalk: 10 μm, x 3000).(B) U87 glioomcelproliferatie werd bepaald door celproliferatietest.U87-glioomcellen werden gedurende de aangegeven tijd behandeld met exosomen. *P < 0,05 werd verkregen door Student's t-test. *P < 0,05 werd verkregen door Student's t-test. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 volgens Student's t-test. *P < 0.05 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 verkregen met Student's t-test.
Na bevestiging van de internalisatie van BV2-afgeleide exosomen in U87-glioomcellen, voerden we celproliferatietesten uit om de rol van BV2-afgeleide Toxoplasma-afgeleide exosomen in de ontwikkeling van menselijke glioomcellen te onderzoeken.Behandeling van U87-cellen met exosomen van met T. gondii geïnfecteerde BV2-cellen toonde aan dat met T. gondii geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen een significant hogere proliferatie van U87-cellen veroorzaakten in vergelijking met controle (Fig. 2B).
Bovendien had de groei van U118-cellen dezelfde resultaten als die van U87, aangezien door Toxoplasma gestimuleerde exosomen de hoogste niveaus van proliferatie veroorzaakten (gegevens niet getoond).Op basis van deze gegevens kunnen we aangeven dat BV2-afgeleide Toxoplasma-geïnfecteerde exosomen een belangrijke rol spelen bij de proliferatie van glioomcellen.
Om het effect van met Toxoplasma geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen op de ontwikkeling van tumoren te onderzoeken, injecteerden we U87-glioomcellen in naakte muizen voor een xenotransplantaatmodel en injecteerden we BV2-afgeleide exosomen of RH-geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen.Nadat tumoren na 1 week duidelijk werden, werd elke experimentele groep van 5 muizen verdeeld volgens tumorgrootte om hetzelfde startpunt te bepalen, en de tumorgrootte werd gedurende 22 dagen gemeten.
Bij muizen met het U87 xenograft-model werden op dag 22 significant grotere tumorgrootte en -gewicht waargenomen in de BV2-afgeleide RH-geïnfecteerde exosoomgroep (Fig. 3A, B).Aan de andere kant was er geen significant verschil in tumorgrootte tussen de BV2-afgeleide exosoomgroep en de controlegroep na exosoombehandeling.Bovendien vertoonden muizen geïnjecteerd met glioomcellen en exosomen visueel het grootste tumorvolume in de groep van RH-geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen (figuur 3C).Deze resultaten tonen aan dat BV2-afgeleide Toxoplasma-geïnfecteerde exosomen glioomgroei induceren in een muizentumormodel.
Oncogenese (AC) van BV2-afgeleide exosomen in een U87 xenograft muismodel.Tumorgrootte (A) en gewicht (B) waren significant verhoogd in BALB/c naakte muizen behandeld met RH-geïnfecteerde exosomen afkomstig van BV2.BALB/c naakte muizen (C) werden subcutaan geïnjecteerd met 1 x 107 U87-cellen gesuspendeerd in Matrigel-mengsel.Zes dagen na injectie werd 100 μg van BV2-afgeleide exosomen in muizen behandeld.De grootte en het gewicht van de tumor werden respectievelijk op de aangegeven dagen en na opoffering gemeten. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05。 *P < 0,05。 *Р < 0,05. *P < 0,05.
De gegevens toonden aan dat 37 miRNA's (16 tot overexpressie gebracht en 21 tot downexpressie gebracht) geassocieerd met immuniteit of tumorontwikkeling significant waren veranderd in microglia na infectie met de Toxoplasma RH-stam (Fig. 4A).Relatieve expressieniveaus van miR-21 onder veranderde miRNA's werden bevestigd door real-time RT-PCR in exosomen afgeleid van BV2, exosomen behandeld met BV2- en U87-cellen.Expressie van miR-21 vertoonde een significante toename van exosomen van BV2-cellen die waren geïnfecteerd met Toxoplasma gondii (RH-stam) (figuur 4B).Relatieve expressieniveaus van miR-21 in BV2- en U87-cellen namen toe na opname van veranderde exosomen (figuur 4B).De relatieve niveaus van miR-21-expressie in de hersenweefsels van tumorpatiënten en muizen die waren geïnfecteerd met Toxoplasma gondii (ME49-stam) waren respectievelijk hoger dan in controles (figuur 4C).Deze resultaten correleren met verschillen tussen de expressieniveaus van voorspelde en bevestigde microRNA's in vitro en in vivo.
Veranderingen in de expressie van exosomale miP-21a-5p in microglia geïnfecteerd met Toxoplasma gondii (RH).(A) Toont significante veranderingen aan in siRNA geassocieerd met immuniteit of tumorontwikkeling na infectie met T. gondii RH.(B) Relatieve miR-21-expressieniveaus werden gedetecteerd door real-time RT-PCR in van BV2 afgeleide exosomen, met BV2 behandelde exosomen en U87-cellen.(C) Relatieve miR-21-expressieniveaus werden gevonden in de hersenweefsels van tumorpatiënten (N=3) en muizen geïnfecteerd met Toxoplasma gondii (ME49-stam) (N=3). *P < 0,05 werd verkregen door Student's t-test. *P < 0,05 werd verkregen door Student's t-test. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 werd verkregen met Student's t-test. *P < 0.05 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 verkregen met Student's t-test.
Exosomen van RH-geïnfecteerde BV2-cellen leidden tot de groei van gliomen in vivo en in vitro (Fig. 2, 3).Om relevante mRNA's te detecteren, onderzochten we mRNA-niveaus van antitumordoelgenen, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN en geprogrammeerde celdood 4 (PDCD4) in U87-cellen die zijn geïnfecteerd met exosomen afgeleid van BV2 of RH BV2.Bio-informatica-analyse heeft aangetoond dat verschillende tumor-geassocieerde genen, waaronder de FoxO1-, PTEN- en PDCD4-genen, miR-2121,22-bindingsplaatsen hebben.mRNA-niveaus van antitumordoelgenen waren verlaagd in RH-geïnfecteerde van BV2 afgeleide exosomen in vergelijking met van BV2 afgeleide exosomen (Fig. 5A).FoxO1 vertoonde verlaagde eiwitniveaus in RH-geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen in vergelijking met BV2-afgeleide exosomen (Figuur 5B).Op basis van deze resultaten konden we bevestigen dat exosomen afkomstig van RH-geïnfecteerde BV2 anti-oncogene genen downreguleren en hun rol in tumorgroei behouden.
Toxoplasma RH-geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen induceren onderdrukking van antitumorgenen in U87 glioomcellen door Toxoplasma RH-geïnfecteerde BV2-afgeleide exosomen.( A ) Realtime PCR van FoxO1-, PTEN- en PDCD4-expressie in exosomen afgeleid van T. gondii RH-geïnfecteerde BV2 in vergelijking met PBS-exosomen.P-actine-mRNA werd als controle gebruikt.(B) FoxO1-expressie werd bepaald door Western-blotting en densitometriegegevens werden statistisch geëvalueerd met behulp van het ImageJ-programma. *P < 0,05 werd verkregen door Student's t-test. *P < 0,05 werd verkregen door Student's t-test. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 werd verkregen met Student's t-test. *P < 0.05 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 verkregen met Student's t-test.
Om het effect van miP-21 in exosomen op tumor-geassocieerde genregulatie te begrijpen, werden U87-cellen getransfecteerd met een remmer van miP-21 met behulp van Lipofectamine 2000 en werden de cellen 24 uur na transfectie geoogst.FoxO1- en p27-expressieniveaus in cellen getransfecteerd met miR-21-remmers werden vergeleken met cellen die waren behandeld met van BV2 afgeleide exosomen met behulp van qRT-PCR (Fig. 6A, B).Transfectie van de miR-21-remmer in U87-cellen verlaagde de FoxO1- en p27-expressie aanzienlijk (FIG. 6).
RH-geïnfecteerde exosomale BV2-afgeleide miP-21 veranderde FoxO1 / p27-expressie in U87-glioomcellen.U87-cellen werden getransfecteerd met miP-21-remmer met behulp van Lipofectamine 2000 en cellen werden 24 uur na transfectie geoogst.FoxO1- en p27-expressieniveaus in cellen getransfecteerd met miR-21-remmers werden vergeleken met niveaus in cellen die werden behandeld met van BV2 afgeleide exosomen met behulp van qRT-PCR (A, B).
Om aan de immuunrespons van de gastheer te ontsnappen, verandert de Toxoplasma-parasiet in een weefselcyste.Ze parasiteren verschillende weefsels, waaronder de hersenen, het hart en de skeletspieren, gedurende het hele leven van de gastheer en moduleren de immuunrespons van de gastheer.Bovendien kunnen ze de celcyclus en apoptose van gastheercellen reguleren, waardoor hun proliferatie wordt bevorderd14,24.Toxoplasma gondii infecteert voornamelijk dendritische cellen van de gastheer, neutrofielen en monocyten/macrofagen, inclusief hersenmicroglia.Toxoplasma gondii induceert de differentiatie van macrofagen van het M2-fenotype, beïnvloedt wondgenezing na infectie met pathogenen en wordt ook geassocieerd met hypervascularisatie en granulomateuze fibrose.Deze gedragspathogenese van Toxoplasma-infectie kan verband houden met markers die verband houden met tumorontwikkeling.De vijandige omgeving die door Toxoplasma wordt gereguleerd, kan lijken op de overeenkomstige prekanker.Daarom kan worden aangenomen dat Toxoplasma-infectie zou moeten bijdragen aan de ontwikkeling van hersentumoren.Er zijn zelfs hoge percentages Toxoplasma-infectie gemeld in het serum van patiënten met verschillende hersentumoren.Bovendien kan Toxoplasma gondii een andere kankerverwekkende effector zijn en synergetisch werken om andere besmettelijke kankerverwekkende stoffen te helpen hersentumoren te ontwikkelen.In dit opzicht is het vermeldenswaard dat P. falciparum en het Epstein-Barr-virus synergetisch bijdragen aan de vorming van Burkitt-lymfoom.
De rol van exosomen als regulatoren op het gebied van kankeronderzoek is uitgebreid onderzocht.De rol van exosomen tussen parasieten en geïnfecteerde gastheren blijft echter slecht begrepen.Tot nu toe hebben verschillende regulatoren, waaronder uitgescheiden eiwitten, de biologische processen verklaard waarmee protozoaire parasieten gastheeraanvallen weerstaan ​​en infectie in stand houden.Onlangs is er een groeiend concept dat protozoa-geassocieerde microvesicles en hun microRNA's interageren met gastheercellen om een ​​gunstige omgeving te creëren voor hun overleving.Daarom zijn verdere studies nodig om de relatie tussen veranderde exosomale miRNA's en proliferatie van glioomcellen te ontdekken.MicroRNA-verandering (clustergenen miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 en miR-17-92) bindt aan de STAT3-promoter in met toxoplasma geïnfecteerde menselijke macrofagen, wordt gereguleerd en induceert anti -apoptose als reactie op infectie met Toxoplasma gondii 29 .Toxoplasma-infectie verhoogt de expressie van miR-17-5p en miR-106b-5p, die geassocieerd zijn met verschillende hyperproliferatieve ziekten 30 .Deze gegevens suggereren dat gastheer-miRNA's gereguleerd door Toxoplasma-infectie belangrijke moleculen zijn voor de overleving van parasieten en pathogenese in biologisch gedrag van de gastheer.
Veranderde miRNA's kunnen verschillende soorten gedrag beïnvloeden tijdens de initiatie en progressie van kwaadaardige cellen, waaronder gliomen: zelfvoorziening van groeisignalen, ongevoeligheid voor groeiremmende signalen, ontduiking van apoptose, onbeperkt replicatief potentieel, angiogenese, invasie en metastase en ontsteking.Bij glioom zijn gewijzigde miRNA's geïdentificeerd in verschillende expressieprofileringsonderzoeken.
In de huidige studie hebben we hoge niveaus van miRNA-21-expressie bevestigd in met toxoplasma geïnfecteerde gastheercellen.miR-21 is geïdentificeerd als een van de meest frequent tot overexpressie gebrachte microRNA's in solide tumoren, waaronder gliomen, 33 en de expressie ervan correleert met de graad van glioom.Accumulerend bewijs suggereert dat miR-21 een nieuw oncogen is dat werkt als een anti-apoptotische factor bij de groei van glioom en dat in hoge mate tot overexpressie wordt gebracht in weefsels en plasma van maligniteiten van de menselijke hersenen.Interessant is dat miR-21-inactivatie in glioomcellen en -weefsels de remming van celproliferatie veroorzaakt als gevolg van caspase-afhankelijke apoptose.Bio-informatica-analyse van miR-21 voorspelde doelen onthulde meerdere tumoronderdrukkende genen geassocieerd met apoptose-routes, waaronder geprogrammeerde celdood 4 (PDCD4), tropomyosine (TPM1), PTEN en forkhead box O1 (FoxO1), met de miR-2121-bindingsplaats..22.38.
FoxO1 is als een van de transcriptiefactoren (FoxO) betrokken bij de ontwikkeling van verschillende soorten kanker bij de mens en kan de expressie van tumorsuppressorgenen zoals p21, p27, Bim en FasL40 reguleren.FoxO1 kan celcyclusremmers zoals p27 binden en activeren om celgroei te onderdrukken.Bovendien is FoxO1 een belangrijke effector van PI3K / Akt-signalering en reguleert het vele biologische processen, zoals celcyclusprogressie en celdifferentiatie door activering van p2742-transcriptie.
Concluderend zijn wij van mening dat exosomaal miR-21 afgeleid van met Toxoplasma geïnfecteerde microglia een belangrijke rol kan spelen als groeiregulator van glioomcellen (Fig. 7).Er zijn echter verdere studies nodig om een ​​direct verband te vinden tussen exosomale miR-21, veranderde Toxoplasma-infectie en glioomgroei.Deze resultaten zullen naar verwachting een startpunt bieden voor het bestuderen van de relatie tussen Toxoplasma-infectie en de incidentie van glioom.
In deze studie wordt een schematisch diagram van het mechanisme van glioma (hersen) carcinogenese voorgesteld.De auteur tekent in PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Alle experimentele protocollen in deze studie, inclusief het gebruik van dieren, waren in overeenstemming met de Seoul National University Animal Care and User Committee Standard Ethical Guidelines en werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Seoul National University School of Medicine (IRB-nummer SNU- 150715).-2).Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-aanbevelingen.
BV2 muizenmicroglia en U87 menselijke glioomcellen werden gekweekt in respectievelijk Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) en Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), elk met 10% foetaal runderserum, 4 mM l- glutamine, 0,2 mM penicilline en 0,05 mM streptomycine.Cellen werden gekweekt in een incubator met 5% CO2 bij 37°C.Een andere glioomcellijn, U118, werd gebruikt ter vergelijking met U87-cellen.
Om exosomen te isoleren van met T. gondii geïnfecteerde RH- en ME49-stammen, werden T. gondii-tachyzoïeten (RH-stam) geoogst uit de buikholte van 6 weken oude BALB/c-muizen die 3-4 dagen eerder waren geïnjecteerd.Tachyzoïeten werden driemaal gewassen met PBS en gezuiverd door centrifugeren in 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS)43.Om tachyzoieten van stam ME49 te verkrijgen, werden BALB/c-muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met 20 weefselcysten en werd tachyzoïettransformatie in cysten verzameld door de buikholte te wassen op de 6-8ste dag na infectie (PI).Muizen besmet met PBS.ME49-tachyzoïeten werden gekweekt in cellen aangevuld met 100 μg / ml penicilline (Gibco / BRL, Grand Island, NY, VS), 100 μg / ml streptomycine (Gibco / BRL) en 5% foetaal runderserum (Lonza, Walkersville, MD). .., VS) bij 37 °C en 5% kooldioxide.Na cultivering in Vero-cellen werden ME49-tachyzoïeten tweemaal door een naald van 25 gauge geleid en vervolgens door een filter van 5 µm om afval en cellen te verwijderen.Na wassen werden de tachyzoieten opnieuw gesuspendeerd in PBS44.Weefselcysten van Toxoplasma gondii-stam ME49 werden in stand gehouden door intraperitoneale injectie van cysten geïsoleerd uit de hersenen van geïnfecteerde C57BL / 6-muizen (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).De hersenen van ME49-geïnfecteerde muizen werden geoogst na 3 maanden PI en fijngehakt onder een microscoop om cysten te isoleren.De geïnfecteerde muizen werden onder speciale pathogeenvrije omstandigheden (SPF) gehouden aan de Seoul National University School of Medicine.
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit BV2-afgeleide exosomen, BV2-cellen en weefsels met behulp van de miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant, inclusief de incubatietijd voor de elutiestap.De RNA-concentratie werd bepaald op een NanoDrop 2000 spectrofotometer.De kwaliteit van RNA-microarrays werd beoordeeld met behulp van een Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Amstelveen, Nederland).
DMEM met 10% exosoomarme FBS werd bereid door ultracentrifugatie bij 100.000 g gedurende 16 uur bij 4°C en gefiltreerd door een filter van 0,22 urn (Nalgene, Rochester, NY, VS).BV2-cellen, 5 x 105, werden gekweekt in DMEM met 10% exosoom-verarmde FBS en 1% antibiotica bij 37°C en 5% CO2.Na 24 uur incubatie werden tachyzoïeten van stam RH of ME49 (MOI = 10) aan de cellen toegevoegd en niet-invasieve parasieten werden binnen een uur verwijderd en opnieuw gevuld met DMEM.Exosomen van BV2-cellen werden geïsoleerd door gemodificeerde differentiële centrifugatie, de meest gebruikte methode.Resuspendeer de exosoompellet in 300 µl PBS voor RNA- of eiwitanalyse.De concentratie van geïsoleerde exosomen werd bepaald met behulp van een BCA-eiwitassaykit (Pierce, Rockford, IL, VS) en een NanoDrop 2000-spectrofotometer.
Precipitaten van BV2-cellen of exosomen afgeleid van BV2 werden gelyseerd in PRO-PREP™-eiwitextractie-oplossing (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) en eiwitten werden geladen op met Coomassie briljantblauw gekleurde 10% SDS-polyacrylamidegels.Bovendien werden eiwitten gedurende 2 uur overgebracht naar PVDF-membranen.Western-blots werden gevalideerd met behulp van het Alix-antilichaam (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS) als een exosomale marker.HRP-geconjugeerd anti-muis-IgG van geit (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, VS) en een LAS-1000 plus luminescente beeldanalysator (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) werden gebruikt als een secundair antilichaam..Transmissie-elektronenmicroscopie werd uitgevoerd om de grootte en morfologie van exosomen te bestuderen.Exosomen geïsoleerd uit BV2-cellen (6,40 µg/µl) werden bereid op met koolstof beklede mazen en negatief gekleurd met 2% uranylacetaat gedurende 1 minuut.De voorbereide monsters werden waargenomen bij een versnellingsspanning van 80 kV met behulp van een JEOL 1200-EX II (Tokio, Japan) uitgerust met een ES1000W Erlangshen CCD-camera (Gatan, Pleasanton, CA, VS).
Van BV2 afgeleide exosomen werden gekleurd met behulp van de PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.U87-cellen, 2 x 105, met PKH26-gelabelde exosomen (rood) of geen exosomen als negatieve controle, werden 24 uur bij 37°C geïncubeerd in een 5% CO2-incubator.U87-celkernen werden gekleurd met DAPI (blauw), U87-cellen werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij 4 ° C en vervolgens geanalyseerd in een Leica TCS SP8 STED CW confocaal microscoopsysteem (Leica Microsystems, Mannheim, Duitsland).waarneembaar.
cDNA werd gesynthetiseerd uit siRNA met behulp van Mir-X siRNA eerste strengsynthese en SYBR qRT-PCR-kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Realtime kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met behulp van het iQ5 real-time PCR-detectiesysteem (Bio-Rad, Hercules, CA, VS) met behulp van primers en sjablonen gemengd met SYBR Premix.DNA werd geamplificeerd gedurende 40 cycli van denaturatie bij 95°C gedurende 15 seconden en hybridisatie bij 60°C gedurende 60 seconden.De gegevens van elke PCR-reactie werden geanalyseerd met behulp van de gegevensanalysemodule van de iQ™5 optische systeemsoftware (Bio-Rad).Relatieve veranderingen in genexpressie tussen geselecteerde doelwitgenen en β-actine / siRNA (en U6) werden berekend met behulp van de standaardcurvemethode.De gebruikte primersequenties worden weergegeven in tabel 1.
3 x 104 U87-glioomcellen werden uitgezaaid in platen met 96 putjes en gemengd met met Toxoplasma geïnfecteerde exosomen afgeleid van BV2 (50 μg/ml) of niet-gepulseerde exosomen afgeleid van BV2 (50 μg/ml) als controles na 12, 18 en 36 uur .De celproliferatiesnelheid werd bepaald met behulp van de Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (aanvullende figuren S1-S3) 46 .
Vrouwelijke naakte BALB/c-muizen van 5 weken oud werden gekocht bij Orient Bio (Seongnam-si, Zuid-Korea) en afzonderlijk in steriele kooien gehouden bij kamertemperatuur (22 ± 2 °C) en vochtigheid (45 ± 15 °C).%) bij kamertemperatuur (22±2°C) en vochtigheid (45±15%).Een lichtcyclus van 12 uur en een donkere cyclus van 12 uur werden uitgevoerd onder SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Muizen werden willekeurig verdeeld in drie groepen van elk 5 muizen en alle groepen werden subcutaan geïnjecteerd met 400 ml PBS met 1 x 107 U87-glioomcellen en BD Matrigel™ met verminderde groeifactor (BD Science, Miami, FL, VS).Zes dagen na tumorinjectie werd 200 mg exosomen afkomstig van BV2-cellen (met/zonder Toxoplasma-infectie) in de tumorplaats geïnjecteerd.Tweeëntwintig dagen na tumorinfectie werd de tumorgrootte van muizen in elke groep drie keer per week gemeten met een schuifmaat en het tumorvolume werd berekend met de formule: 0,5 x (breedte) x 2 x lengte.
MicroRNA-expressie-analyse met behulp van miRCURYTM LNA miRNA-array, 7e generatie heeft, mmu- en rno-arrays (EXIQON, Vedbaek, Denemarken) met 1119 goed gekarakteriseerde muizen onder 3100 miRNA-captureprobes van mens, muis en rat.Tijdens deze procedure werd 250 tot 1000 ng totaal RNA uit het 5'-fosfaat verwijderd door behandeling met alkalische fosfatase uit kalfsdarm gevolgd door labeling met Hy3 groene fluorescerende kleurstof.De gelabelde monsters werden vervolgens gehybridiseerd door microarray-objectglaasjes te laden met behulp van een hybridisatiekamerkit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, VS) en een hybridisatie-glaasjeskit (Agilent Technologies).Hybridisatie werd gedurende 16 uur bij 56°C uitgevoerd, daarna werden de microarrays gewassen in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant.De verwerkte microarray-dia's werden vervolgens gescand met behulp van een Agilent G2565CA microarray-scannersysteem (Agilent Technologies).Gescande afbeeldingen werden geïmporteerd met Agilent Feature Extraction-software versie 10.7.3.1 (Agilent Technologies) en de fluorescentie-intensiteit van elke afbeelding werd gekwantificeerd met behulp van het overeenkomstige GAL-bestand van het gewijzigde Exiqon-protocol.Microarray-gegevens voor het huidige onderzoek zijn gedeponeerd in de GEO-database onder toegangsnummer GPL32397.
Expressieprofielen van volwassen exosomale miRNA's in microglia van RH- of ME49-stammen geïnfecteerd met Toxoplasma werden geanalyseerd met behulp van verschillende netwerktools.miRNA's geassocieerd met tumorontwikkeling werden geïdentificeerd met behulp van miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) en uitgefilterd met genormaliseerde signaalintensiteit (log2) groter dan 8,0.Onder miRNA's bleken differentieel tot expressie gebrachte miRNA's meer dan 1,5 keer veranderd te zijn door filteranalyse van miRNA's veranderd door RH- of ME49-stammen die waren geïnfecteerd met T. gondii.
Cellen werden gezaaid in platen met zes putjes (3 x 105 cellen / putje) in opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, VS) met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS).De getransfecteerde cellen werden 6 uur gekweekt en daarna werd het medium vervangen door vers volledig medium.Cellen werden 24 uur na transfectie geoogst.
Statistische analyse werd voornamelijk uitgevoerd met behulp van Student's t-test met Excel-software (Microsoft, Washington, DC, VS).Voor experimentele dieranalyse werd een tweerichtings-ANOVA uitgevoerd met behulp van Prism 3.0-software (GraphPad Software, La Jolla, CA, VS). P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Значения P <0,05 met verschillende waarden. P-waarden <0,05 werden als statistisch significant beschouwd. P 值< 0.05 P 值 < 0,05 Значения P <0,05 met verschillende waarden. P-waarden <0,05 werden als statistisch significant beschouwd.
Alle experimentele protocollen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Seoul National University School of Medicine (IRB-nummer SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Geschatte wereldwijde incidentie en mortaliteit van kanker in 2018: bronnen en methoden van GLOBOCAN.Interpretatie.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Een inzicht in de risicofactoren van hersentumoren en hun therapeutische interventies. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Een inzicht in de risicofactoren van hersentumoren en hun therapeutische interventies.Rashid, S., Rehman, K. en Akash, MS Een overzicht van risicofactoren voor hersentumoren en belangrijke therapeutische interventies. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Diep begrip van risicofactoren voor hersentumoren en therapeutische interventies.Rashid, S., Rehman, K. en Akash, MS Een overzicht van risicofactoren voor hersentumoren en belangrijke therapeutische interventies.Biomedische wetenschappen.Apotheker.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacterieel-virale interacties bij menselijke orodigestieve en vrouwelijke geslachtsorganen: een samenvatting van epidemiologisch en laboratoriumbewijs. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacterieel-virale interacties bij menselijke orodigestieve en vrouwelijke geslachtsorganen: een samenvatting van epidemiologisch en laboratoriumbewijs.Kato I., Zhang J. en Sun J. Bacterieel-virale interacties bij kanker van het menselijke maagdarmkanaal en het vrouwelijke geslachtsorgaan: een samenvatting van epidemiologische en laboratoriumgegevens. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacteriovirale interactie in de spijsvertering van de menselijke mondholte en het vrouwelijke voortplantingsstelsel: samenvatting van populaire ziektewetenschap en laboratoriumbewijs.Kato I., Zhang J. en Sun J. Bacterieel-virale interacties bij menselijke gastro-intestinale kanker en vrouwelijke genitale kanker: een samenvatting van epidemiologische en laboratoriumgegevens.Kanker 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Van infectie tot kanker: hoe DNA-tumorvirussen het centrale koolstof- en lipidenmetabolisme van de gastheercel veranderen. Magon, KL & Parish, JL Van infectie tot kanker: hoe DNA-tumorvirussen het centrale koolstof- en lipidenmetabolisme van de gastheercel veranderen.Mahon, KL en Parish, JL Vuurinfectie tot kanker: hoe op DNA gebaseerde tumorvirussen het centrale koolstof- en lipidenmetabolisme van de gastheercel veranderen. Magon, KL & Parish, JL Magon, KL & Parish, JL Van infectie tot kanker: hoe DNA-tumorvirussen het centrale koolstof- en lipidenmetabolisme van de gastheercel veranderen.Mahon, KL en Parish, JL Brandt infectie tot kanker: hoe DNA-tumorvirussen het centrale koolstof- en lipidenmetabolisme in gastheercellen veranderen.Biologie openen.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Catechol-oestrogenen van schistosomen en leverwormen en worm-geassocieerde kanker.voorkant.warm van binnen.5, 444 (2014).